實(shí)驗(yàn)方法

 結(jié)果展示

正離子模式下總離子流圖（TIC）

負(fù)離子模式下總離子流圖（TIC）

Annotation	RI	mz	rt	rtmins	KEGG	B10	B11
Pyruvic acid	1052.7	174.0932035	425.617	7.093616667	C00022	0.3565036	0.056507411
Lactic acid	1064.7	117.0999985	436.85	7.280833333	C00186	4.747036327	3.344078952
Glycolic acid	1078.8	177.1000061	449.6945	7.494908333	C00160	1.326885339	0.527382498
Alanine	1107.6	116.1432731	476.326	7.938766667	C00041	3.028170541	3.084627979
Oxalic acid	1136	190.1000061	502.318	8.371966667	C00209	0.194537206	0.091481498
Heptanoic acid	1177.8	144.1581335	539.863	8.997716667	C17714	0.115500201	0.128741438
2-Aminobutyric acid	1178.3	130.1487871	540.51	9.0085	C02356	0.364989578	0.079262412
Methylmalonic acid	1203	247.0898469	562.6535	9.377558333	C02170	0.035611705	0.005913077
Valine	1223.2	144.1828377	579.983	9.666383333	C00183	1.50831138	0.379191532
4-Hydroxybutanoic acid	1239.1	117.0711577	593.143	9.885716667	C01770	0.146412544	0.086628849
Urea	1246.4	189.1000061	599.877	9.99795	C00086	0.07279439	0.009963712
Benzoic acid	1252.1	179.0967188	604.696	10.07826667	C00180	0.757627476	1.088216438
1,3-Di-Tert-Butylbenzene	1261.3	175.1661048	612.737	10.21228333	NA	0.934027453	0.03662111
Ethanolamine	1275.3	174.1877773	624.2735	10.40455833	C00189	6.510647873	1.843890014
Leucine	1279.6	158.1784614	628.416	10.4736	C00123	0.941304245	0.363700099
Glycerol	1283.5	205.1000061	632.9085	10.548475	C00116	18.67529482	22.50317805
Phosphoric acid	1284	299.1000061	633.189	10.55315	C00009	536.4761026	661.2377331
Proline	1306.1	142.1501043	650.863	10.84771667	C00148	0.322801402	0.080096555
Glycine	1316.6	174.1862447	658.924	10.98206667	C00037	16.92097907	17.66554668
Succinic acid	1316.9	247.1574299	659.2495	10.98749167	C00042	0.723656144	0.531405997
Glyceric acid	1341	292.1895564	678.819	11.31365	C00258	0.793085658	0.10722067
Uracil	1347.4	241.1000061	683.955	11.39925	C00106	0.740366515	0.203055317
Fumaric acid	1349.6	245.1000061	685.522	11.42536667	C00122	0.490779555	0.201807865
Nonanoic acid	1362.1	215.1775755	695.503	11.59171667	C01601	0.071946663	0.060307398
Serine	1370.9	204.1952103	702.576	11.7096	C00065	4.056129365	3.551741534

正模式下樣品中代謝物鑒定結(jié)果

代謝物分類圖

PCA得分圖

差異代謝物熱圖

代謝通路影響因子圖

 參考文獻(xiàn)

1 植物代謝組學(xué)的典型，研究以質(zhì)譜為基礎(chǔ)，進(jìn)行了一些了的整合分析。Bais P., et al. 2012. Plantmetabolomics.org: mass spectrometry-based Arabidopsis metabolomics- database and tools update. Nucleic Acids Res. 2012 Jan;40(Database issue):D1216-20. doi: 10.1093/nar/gkr969. Epub 2011 Nov 10.

2 非靶向代謝組學(xué)的實(shí)際案例，文章使用氣相色譜/質(zhì)譜代謝組學(xué)平臺(tái)。Tsugawa H., et al. 2011. Practical non-targeted gas chromatography/mass spectrometry- based metabolomics platform for metabolic phenotype analysis. J Biosci Bioeng. 2011 Sep;112(3):292-8. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.05.001. Epub 2011 Jun 8.

非靶向代謝組，首發(fā)于微基生物。

非靶向代謝組學(xué)是將生物體所有內(nèi)源性代謝物作為研究目標(biāo)（廣篩），重點(diǎn)在于比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)尋找其種具有顯著變化的代謝物質(zhì)（差異代謝物），并構(gòu)建代謝通路以解釋代謝物于該生命體的關(guān)聯(lián)

 2 LC—MS的優(yōu)勢(shì)

作為上個(gè)世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，代謝組學(xué)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用在植物學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。代謝組學(xué)的中心任務(wù)是對(duì)內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)，量化和編錄。實(shí)驗(yàn)的發(fā)展是基于分析化學(xué)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，發(fā)展至今，其研究手段也涵蓋了核磁共振（NMR）、氣相色譜（GC）、液相色譜（LC）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)。
在眾多儀器中，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是使用最多的，相對(duì)于NMR，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的精度更高，能鑒定出絕大多數(shù)代謝物，而且成本費(fèi)用也相對(duì)較少，這也是現(xiàn)今色質(zhì)聯(lián)用廣泛被使用的主要原因。而LC-MS除了可以分析GC-MS所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：

1 分析范圍廣，MS幾乎可以檢測(cè)所有的化合物，更加容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題；

2 分離能力強(qiáng)，即使被分析混合物在色譜上沒有完全分離開，但通過MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來最終進(jìn)行定性定量；

3 定性分析結(jié)果可靠，可以同時(shí)給出每一個(gè)組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；

4 檢測(cè)限低，MS具備高靈敏度，通過選擇離子檢測(cè)（SIM）方式，其檢測(cè)能力還可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上；

5 分析時(shí)間快，HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時(shí)間，提高了分離效果；

6 自動(dòng)化程度高，HPLC-MS具有高度的自動(dòng)化。
關(guān)于質(zhì)譜，根據(jù)質(zhì)譜的工作原理，質(zhì)譜又分成了雙聚焦質(zhì)譜儀，四極桿質(zhì)譜儀，飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，離子阱質(zhì)譜儀，傅立葉變換質(zhì)譜儀等不同種類。而在實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們可以根據(jù)不同需要適當(dāng)調(diào)整儀器組和以及儀器附件。

 3 使用儀器

儀器型號(hào)

Agilent 1290/6545 UHPLC-QTOF/MS

Agilent 1290/6538 UHPLC-QTOF/MS

Agilent 6470 UHPLC-QqQ/MS

AB Sciex QTRAP® 6500 LC-MS/MS

產(chǎn)品特性：

● 自動(dòng)調(diào)諧技術(shù)有助于保留不穩(wěn)定化合物以便改進(jìn)檢測(cè)。

● 全新的快速自動(dòng)調(diào)諧將小分子應(yīng)用的靈敏度大幅高提升。

● 全新的安捷倫高壓脈沖發(fā)生器和電源提高了質(zhì)量分辨率性能，同時(shí)將質(zhì)量準(zhǔn)確度提升到了0.8 ppm

● 全新的離子光學(xué)元件具有更出色的穩(wěn)定性，新型6545 Q-TOF 將軟件與硬件的創(chuàng)新進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，使儀器質(zhì)量、儀器穩(wěn)定性及其整體性能均得到了顯著提高。

 4 實(shí)驗(yàn)方法

 5 結(jié)果展示

正離子模式下總離子流圖（TIC）

負(fù)離子模式下總離子流圖（TIC）

Annotation	RI	mz	rt	rtmins	KEGG	B10	B11
Pyruvic acid	1052.7	174.0932035	425.617	7.093616667	C00022	0.3565036	0.056507411
Lactic acid	1064.7	117.0999985	436.85	7.280833333	C00186	4.747036327	3.344078952
Glycolic acid	1078.8	177.1000061	449.6945	7.494908333	C00160	1.326885339	0.527382498
Alanine	1107.6	116.1432731	476.326	7.938766667	C00041	3.028170541	3.084627979
Oxalic acid	1136	190.1000061	502.318	8.371966667	C00209	0.194537206	0.091481498
Heptanoic acid	1177.8	144.1581335	539.863	8.997716667	C17714	0.115500201	0.128741438
2-Aminobutyric acid	1178.3	130.1487871	540.51	9.0085	C02356	0.364989578	0.079262412
Methylmalonic acid	1203	247.0898469	562.6535	9.377558333	C02170	0.035611705	0.005913077
Valine	1223.2	144.1828377	579.983	9.666383333	C00183	1.50831138	0.379191532
4-Hydroxybutanoic acid	1239.1	117.0711577	593.143	9.885716667	C01770	0.146412544	0.086628849
Urea	1246.4	189.1000061	599.877	9.99795	C00086	0.07279439	0.009963712
Benzoic acid	1252.1	179.0967188	604.696	10.07826667	C00180	0.757627476	1.088216438
1,3-Di-Tert-Butylbenzene	1261.3	175.1661048	612.737	10.21228333	NA	0.934027453	0.03662111
Ethanolamine	1275.3	174.1877773	624.2735	10.40455833	C00189	6.510647873	1.843890014
Leucine	1279.6	158.1784614	628.416	10.4736	C00123	0.941304245	0.363700099
Glycerol	1283.5	205.1000061	632.9085	10.548475	C00116	18.67529482	22.50317805
Phosphoric acid	1284	299.1000061	633.189	10.55315	C00009	536.4761026	661.2377331
Proline	1306.1	142.1501043	650.863	10.84771667	C00148	0.322801402	0.080096555
Glycine	1316.6	174.1862447	658.924	10.98206667	C00037	16.92097907	17.66554668
Succinic acid	1316.9	247.1574299	659.2495	10.98749167	C00042	0.723656144	0.531405997
Glyceric acid	1341	292.1895564	678.819	11.31365	C00258	0.793085658	0.10722067
Uracil	1347.4	241.1000061	683.955	11.39925	C00106	0.740366515	0.203055317
Fumaric acid	1349.6	245.1000061	685.522	11.42536667	C00122	0.490779555	0.201807865
Nonanoic acid	1362.1	215.1775755	695.503	11.59171667	C01601	0.071946663	0.060307398
Serine	1370.9	204.1952103	702.576	11.7096	C00065	4.056129365	3.551741534

正模式下樣品中代謝物鑒定結(jié)果

代謝物分類圖

PCA得分圖

差異代謝物熱圖

代謝通路影響因子圖

LC-MS非靶向代謝組，首發(fā)于微基生物。

GC-MS是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、物理學(xué)，氣相色譜的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。
當(dāng)多組分的混合樣品進(jìn)入色譜柱后，由于吸附劑對(duì)每個(gè)組分的吸附力不同，經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來，最先離開色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，而吸附力最強(qiáng)的組分最不容易被解吸下來，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進(jìn)入檢測(cè)器中被檢測(cè)、記錄下來。
質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，其基本原理 是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。

 2 實(shí)驗(yàn)方法

 3 儀器及優(yōu)勢(shì)

儀器

Agilent GC-FID-MS

LECO Pegasus 4D GC*GC-TOF MS

氣相色譜（GAS CHROMATOGRAPHY，GC）具有極強(qiáng)的分離能力，在精確度上遠(yuǎn)勝同類儀器；系統(tǒng)的生態(tài)運(yùn)行模式（ECO MODE）可以減少儀器待機(jī)時(shí)電能和載氣不必要的消耗；氣相色譜法–質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS)是一種結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜的特性，在試樣中鑒別不同物質(zhì)的方法。 其主要應(yīng)用于工業(yè)檢測(cè)、食品安全、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域。如農(nóng)藥殘留、食品添加劑等；紡織品檢測(cè)如禁用偶氮染料、含氯苯酚檢測(cè)等?；瘖y品檢測(cè)如二惡烷，香精香料檢測(cè)等；電子電器產(chǎn)品檢測(cè)，如多溴聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯醚檢測(cè)等；物證檢驗(yàn)中可能涉及各種各樣的復(fù)雜化合物，氣質(zhì)聯(lián)用儀器對(duì)于這些司法鑒定過程中復(fù)雜化合物的定性定量分析提供強(qiáng)有力的支持。

 4 結(jié)果展示

 差異物質(zhì)篩選

代謝物的定性方法為：使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.06.00 software將差異離子的精確分子量及MS/MS圖譜與本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)時(shí)加成方式正離子模式選擇[M+H]+和[M+Na]+，負(fù)離子模式選擇[M-H]-和[M+FA-H]-，質(zhì)量誤差值選擇30 PPM，并且從搜到的物質(zhì)中移除肽、藥物和毒物。

 通路分析

使用MetaboAnalyst在線分析軟件將HFD組和ND組的差異代謝物對(duì)應(yīng)的KEGG編號(hào)找出來，通路分析物種選擇Mus musculus。將p value < 0.05的通路在KEGG中找出來。HFD組和ND組差異代謝物通路富集分析見圖3上，顯著的通路見圖3下.

 5 文獻(xiàn)案例

案例分析

這篇文章是2017年6月發(fā)表在Nature Medicine雜志上的一篇高分論文，此研究以年輕人作為研究對(duì)象，聯(lián)用了代謝組學(xué)和基因組學(xué)，先在基因組學(xué)方向上，使用宏基因組測(cè)序闡述了中國(guó)人群中腸道菌群的變化，然后通過代謝組學(xué)分析得到氨基酸循環(huán)與肥胖之間的關(guān)系，文章的最后確定了一個(gè)對(duì)肥胖有抑制作用的微生物，多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)。

a.宏基因組測(cè)序并分析 b.將測(cè)序結(jié)果與患者表型關(guān)聯(lián) c.基于測(cè)序結(jié)果的基因功能與代謝通路分析 d.人血液循環(huán)代謝物的分析 e.小鼠模型驗(yàn)證 f.干預(yù)治療
本研究中融合宏基因組測(cè)序、疾病癥狀觀察、血清代謝組學(xué)研究(廣篩和靶向)、小鼠喂食模型和數(shù)據(jù)分析。首先，研究人員對(duì)72名肥胖者和79名苗條的“對(duì)照組”志愿者進(jìn)行了腸道微生物的宏基因組測(cè)序，得到了35024個(gè)與肥胖相關(guān)的基因，把這些基因聚類到宏基因組關(guān)聯(lián)群組(metagenomic linkage groups，MLGs)，并鑒定出它們所對(duì)應(yīng)的微生物。結(jié)果顯示，肥胖人群和苗條人群的腸道微生物確實(shí)存在巨大差異，且肥胖志愿者的腸道微生物多樣性和基因數(shù)量都相對(duì)較低。
同時(shí)，利用GC-MS平臺(tái)對(duì)志愿者血清樣本進(jìn)行代謝組廣篩，得到了148種代謝產(chǎn)物，其中確定結(jié)構(gòu)的有13種，包括谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，之后用靶向氨基酸檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。接著，用宏基因組得出來的結(jié)論與代謝組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)肥胖人群中谷氨酸的含量非常高，與苗條人群的差異也最大，且在肥胖人群中，谷氨酸含量與多形擬桿菌數(shù)量呈反比。

a.利用Co-inertia analysis方法對(duì)217個(gè)MLGs和148種代謝產(chǎn)物進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
b.利用典型相關(guān)分析(Canonical correlation analysis ，CCA)算法計(jì)算20種氨基酸和217個(gè)具顯著差異MLGs的相關(guān)性。
研究人員分別給正常與高脂飲食的小鼠移植了多形擬桿菌，發(fā)現(xiàn)正常小鼠的總脂肪量減少、肌肉量增加；高脂飲食小鼠體重增長(zhǎng)速度也有所減慢。
最后，研究人員找到了23名接受過袖狀胃切除術(shù)的志愿者，并收集了他們?cè)趧倓傋鐾晔中g(shù)、術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月的糞便樣本，對(duì)腸道微生物以及代謝物等的變化進(jìn)行了分析。
結(jié)果顯示，接受手術(shù)的志愿者體重迅速減少，高血糖、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)顯著減輕，代謝循環(huán)中的谷氨酸含量也大大減少。更重要的是，他們腸道中的多形擬桿菌數(shù)量隨著體重的下降慢慢增加。

參考文獻(xiàn)

1 植物代謝組學(xué)的典型，研究以質(zhì)譜為基礎(chǔ)，進(jìn)行了一些了的整合分析。Bais P., et al. 2012. Plantmetabolomics.org: mass spectrometry-based Arabidopsis metabolomics- database and tools update. Nucleic Acids Res. 2012 Jan;40(Database issue):D1216-20. doi: 10.1093/nar/gkr969. Epub 2011 Nov 10.

2 非靶向代謝組學(xué)的實(shí)際案例，文章使用氣相色譜/質(zhì)譜代謝組學(xué)平臺(tái)。Tsugawa H., et al. 2011. Practical non-targeted gas chromatography/mass spectrometry- based metabolomics platform for metabolic phenotype analysis. J Biosci Bioeng. 2011 Sep;112(3):292-8. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.05.001. Epub 2011 Jun 8.

GC-MS非靶向代謝組，首發(fā)于微基生物。