GC-MS非靶向代謝組

 1 分析原理

GC-MS是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、物理學(xué)，氣相色譜的流動(dòng)相為惰性氣體，氣-固色譜法中以表面積大且具有一定活性的吸附劑作為固定相。
當(dāng)多組分的混合樣品進(jìn)入色譜柱后，由于吸附劑對每個(gè)組分的吸附力不同，經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度也就不同。吸附力弱的組分容易被解吸下來，最先離開色譜柱進(jìn)入檢測器，而吸附力最強(qiáng)的組分最不容易被解吸下來，因此最后離開色譜柱。如此，各組分得以在色譜柱中彼此分離，順序進(jìn)入檢測器中被檢測、記錄下來。
質(zhì)譜分析是一種測量離子荷質(zhì)比（電荷-質(zhì)量比）的分析方法，其基本原理 是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進(jìn)入質(zhì)量分析器。在質(zhì)量分析器中，再利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。

 2 實(shí)驗(yàn)方法

 3 儀器及優(yōu)勢

儀器

Agilent GC-FID-MS

LECO Pegasus 4D GC*GC-TOF MS

氣相色譜（GAS CHROMATOGRAPHY，GC）具有極強(qiáng)的分離能力，在精確度上遠(yuǎn)勝同類儀器；系統(tǒng)的生態(tài)運(yùn)行模式（ECO MODE）可以減少儀器待機(jī)時(shí)電能和載氣不必要的消耗；氣相色譜法–質(zhì)譜法聯(lián)用（GC-MS)是一種結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜的特性，在試樣中鑒別不同物質(zhì)的方法。 其主要應(yīng)用于工業(yè)檢測、食品安全、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域。如農(nóng)藥殘留、食品添加劑等；紡織品檢測如禁用偶氮染料、含氯苯酚檢測等?；瘖y品檢測如二惡烷，香精香料檢測等；電子電器產(chǎn)品檢測，如多溴聯(lián)苯、多溴聯(lián)苯醚檢測等；物證檢驗(yàn)中可能涉及各種各樣的復(fù)雜化合物，氣質(zhì)聯(lián)用儀器對于這些司法鑒定過程中復(fù)雜化合物的定性定量分析提供強(qiáng)有力的支持。

 4 結(jié)果展示

 差異物質(zhì)篩選

代謝物的定性方法為：使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.06.00 software將差異離子的精確分子量及MS/MS圖譜與本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。比對時(shí)加成方式正離子模式選擇[M+H]+和[M+Na]+，負(fù)離子模式選擇[M-H]-和[M+FA-H]-，質(zhì)量誤差值選擇30 PPM，并且從搜到的物質(zhì)中移除肽、藥物和毒物。

 通路分析

使用MetaboAnalyst在線分析軟件將HFD組和ND組的差異代謝物對應(yīng)的KEGG編號找出來，通路分析物種選擇Mus musculus。將p value < 0.05的通路在KEGG中找出來。HFD組和ND組差異代謝物通路富集分析見圖3上，顯著的通路見圖3下.

 5 文獻(xiàn)案例

案例分析

這篇文章是2017年6月發(fā)表在Nature Medicine雜志上的一篇高分論文，此研究以年輕人作為研究對象，聯(lián)用了代謝組學(xué)和基因組學(xué)，先在基因組學(xué)方向上，使用宏基因組測序闡述了中國人群中腸道菌群的變化，然后通過代謝組學(xué)分析得到氨基酸循環(huán)與肥胖之間的關(guān)系，文章的最后確定了一個(gè)對肥胖有抑制作用的微生物，多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)。

a.宏基因組測序并分析 b.將測序結(jié)果與患者表型關(guān)聯(lián) c.基于測序結(jié)果的基因功能與代謝通路分析 d.人血液循環(huán)代謝物的分析 e.小鼠模型驗(yàn)證 f.干預(yù)治療
本研究中融合宏基因組測序、疾病癥狀觀察、血清代謝組學(xué)研究(廣篩和靶向)、小鼠喂食模型和數(shù)據(jù)分析。首先，研究人員對72名肥胖者和79名苗條的“對照組”志愿者進(jìn)行了腸道微生物的宏基因組測序，得到了35024個(gè)與肥胖相關(guān)的基因，把這些基因聚類到宏基因組關(guān)聯(lián)群組(metagenomic linkage groups，MLGs)，并鑒定出它們所對應(yīng)的微生物。結(jié)果顯示，肥胖人群和苗條人群的腸道微生物確實(shí)存在巨大差異，且肥胖志愿者的腸道微生物多樣性和基因數(shù)量都相對較低。
同時(shí)，利用GC-MS平臺對志愿者血清樣本進(jìn)行代謝組廣篩，得到了148種代謝產(chǎn)物，其中確定結(jié)構(gòu)的有13種，包括谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，之后用靶向氨基酸檢測進(jìn)行驗(yàn)證。接著，用宏基因組得出來的結(jié)論與代謝組檢測結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)肥胖人群中谷氨酸的含量非常高，與苗條人群的差異也最大，且在肥胖人群中，谷氨酸含量與多形擬桿菌數(shù)量呈反比。

a.利用Co-inertia analysis方法對217個(gè)MLGs和148種代謝產(chǎn)物進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
b.利用典型相關(guān)分析(Canonical correlation analysis ，CCA)算法計(jì)算20種氨基酸和217個(gè)具顯著差異MLGs的相關(guān)性。
研究人員分別給正常與高脂飲食的小鼠移植了多形擬桿菌，發(fā)現(xiàn)正常小鼠的總脂肪量減少、肌肉量增加；高脂飲食小鼠體重增長速度也有所減慢。
最后，研究人員找到了23名接受過袖狀胃切除術(shù)的志愿者，并收集了他們在剛剛做完手術(shù)、術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月的糞便樣本，對腸道微生物以及代謝物等的變化進(jìn)行了分析。
結(jié)果顯示，接受手術(shù)的志愿者體重迅速減少，高血糖、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)顯著減輕，代謝循環(huán)中的谷氨酸含量也大大減少。更重要的是，他們腸道中的多形擬桿菌數(shù)量隨著體重的下降慢慢增加。

參考文獻(xiàn)

1 植物代謝組學(xué)的典型，研究以質(zhì)譜為基礎(chǔ)，進(jìn)行了一些了的整合分析。Bais P., et al. 2012. Plantmetabolomics.org: mass spectrometry-based Arabidopsis metabolomics- database and tools update. Nucleic Acids Res. 2012 Jan;40(Database issue):D1216-20. doi: 10.1093/nar/gkr969. Epub 2011 Nov 10.

2 非靶向代謝組學(xué)的實(shí)際案例，文章使用氣相色譜/質(zhì)譜代謝組學(xué)平臺。Tsugawa H., et al. 2011. Practical non-targeted gas chromatography/mass spectrometry- based metabolomics platform for metabolic phenotype analysis. J Biosci Bioeng. 2011 Sep;112(3):292-8. doi: 10.1016/j.jbiosc.2011.05.001. Epub 2011 Jun 8.