牙菌斑、唾液、 痰液 、舌苔的采集保存方法

樣本的采集方法往往影響著后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微基生物搜集了多篇文獻(xiàn)，將人體牙菌斑、唾液、痰液、舌苔的微生物的采集方法進(jìn)行了匯總。下述采集方法僅供參考，具體實(shí)驗(yàn)的采集方法，還需根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行具體設(shè)定。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，確定選擇受試者的條件，如考慮年齡、身體健康、牙齒數(shù)量、牙齒健康狀況、有無特殊疾病等因素。根據(jù)考慮的因素，選擇符合條件的受試者。向受試者交代實(shí)驗(yàn)的目的、過程、風(fēng)險(xiǎn)、收益及退出機(jī)制等，確保受試者理解全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，待受試者簽訂知情同意書后開始取樣。

1 樣本的采集

1.1 牙菌斑

受試者無其他口腔疾病，無家族遺傳疾病，無系統(tǒng)性疾病，無長期服藥史， 近3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素服及免疫抑制劑。

取樣前天晚上不要刷牙，第二天早上在未進(jìn)食前取樣。首先用無菌生理鹽水沖洗收集區(qū)，棉卷隔濕，之后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，用采集拭子分別采集牙齒的舌面、 唇面、齲齒損傷區(qū)等部位的牙菌斑。采集時(shí)，建議由同一操作者進(jìn)行牙菌斑的采 集操作。采集時(shí)在采集部位來回刮擦 3-4 次，之后翻轉(zhuǎn)采集拭子，在同一部位繼續(xù)進(jìn)行刮擦 3-4 次，每個(gè)樣本均采用一個(gè)采集拭子進(jìn)行采集。采集完成后，將帶有牙菌斑的采集拭子置于含有 1ml TE 溶液的無菌保存管中，掰斷采集拭子后， 對保存管進(jìn)行封口。置于冰上，待樣本采集完后，盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，放入-80℃ 冰箱進(jìn)行保存。

若無法實(shí)現(xiàn)低溫保存，可以采用微基生物研發(fā)的口腔微生物 DNA 常溫保存液，可以實(shí)現(xiàn)口腔微生物樣本的DNA檢測常溫保存和運(yùn)輸。

1.2 唾液

建議采集早上、未進(jìn)食的受試者的唾液，若受試者吃過飯，則需在飯后2小時(shí)后再進(jìn)行采樣。采集前，先讓受試者用 20mL 生理鹽水漱口 1min，之后自然口含唾液數(shù)分鐘后，由同一名操作者將滅菌 EP 管置于受檢者下唇口腔黏膜，使唾液自然流入，采集非刺激性唾液樣本 3ml，冷藏，放入-80℃冰箱進(jìn)行保存。

1.3 痰液

1.3.1 能自行留痰者

建議采集早上受試者的痰液，以清晨第一口痰為宜。早上受試者刷牙后，用清水反復(fù)漱口 3 次，之后采用拍背或刺激咳嗽，讓受試者深呼吸數(shù)次后用力咳出氣管深處的痰液，將痰液放入無菌的 EP 管中，蓋好瓶蓋。對于痰液少或者無痰的受試者，可采用霧化吸入加溫至45℃的 10% NaCl 水溶液，可使痰液易于排出。 對于痰液較少的幼兒，可輕輕壓迫胸骨上部的器官，使其咳嗽，將痰液排出。注意痰液中不可混入漱口液、唾液、鼻涕等。若受試者為其他時(shí)間采集，則需多次漱口，除去口腔中的食物殘?jiān)入s物。每個(gè)受試者，需采集 1 口痰。

1.3.2 人工輔助呼吸者

對于無法咳痰等受試者可采用吸痰法收集痰液。由同一名操作者對受試者進(jìn)行痰液收集。操作者戴無菌手套，將痰液收集器連接在負(fù)壓吸引器上，打開吸引器開關(guān)，將導(dǎo)管插入咽喉深部，留取痰液標(biāo)本 5-10ml 后加蓋。采集好的樣本需盡快送至實(shí)驗(yàn)室，放入-80℃冰箱進(jìn)行保存。若需采集多個(gè)樣本，需將采集好的樣本先放入事先準(zhǔn)備好的冰盒（泡沫盒+冰袋）中進(jìn)行保存，之后一起帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.4 舌苔

舌苔的采集，可以用壓舌板刮取的方式，也可以用采集拭子刮取進(jìn)行采集， 但壓舌板刮取舌苔后，轉(zhuǎn)移到保存管中較為麻煩。微基生物對壓舌板刮取和拭子 刮取的微生物做過對比，兩者采集方式采集的微生物結(jié)構(gòu)組成，并未有明顯差異。 推薦拭子刮取舌苔微生物的方式。

采樣面積一般為 2cmX2cm 面積，但具體取樣區(qū)域，取決于具體的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)。手持無菌采集拭子，在采樣的目標(biāo)區(qū)域，從上到下，從左至右，順序刮取幾次，每刮一次，請將拭子旋轉(zhuǎn) 90 度，使拭子每一面都充分刮取到樣本。采樣結(jié)束后，將采集拭子頭掰斷（頭部處有特意設(shè)計(jì)的缺刻處，方便掰斷），放入無菌的螺口管中，旋緊螺口蓋，放入-20℃或-80℃進(jìn)行保存。

若無低溫保存條件，可以采用微基生物研發(fā)的口腔微生物 DNA 常溫保存耗材，包括 1ml 常溫保存液和 2ml 保存管。將采集好樣本的拭子頭，掰斷后沒入保存液中。旋緊螺口蓋，搖晃震蕩保存管數(shù)次，使拭子頭收集的微生物與保存液充分結(jié)合?？梢灾苯觾龃嬗?20℃或-80℃溫度（可保存數(shù)月），或室溫下直接寄送到實(shí)驗(yàn)室（保存液中的拭子頭，室溫可保存 7 天）。

2 樣本的保存和寄送

將樣本放入-80℃冰箱進(jìn)行低溫保存，若條件不允許，可短期（1 個(gè)月內(nèi)）在-20℃冰箱中冷凍保存。注意在樣本凍存期間，請勿反復(fù)凍融。 送樣時(shí)請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰+冰袋），以保證運(yùn)輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3 公斤/天）。在打包時(shí)先放入足量的干冰，之后用冰袋填充泡沫盒中間的空隙，為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用厚一點(diǎn)的泡沫盒。

若采用口腔微生物 DNA 常溫保存耗材，則無需用干冰，可直接快遞含有樣本的保存管即可。