微基生物 您自己的微生態(tài)研究團隊|專注微生態(tài)研究與應(yīng)用
1 檢測對象
關(guān)于特定種類的微生物，客戶可告知物種信息及引物信息，微基生物針對目標微生物進行qPCR定量分析；也可告知感興趣的物種名稱，微基生物來查詢相關(guān)引物信息；如老師感興趣的物種信息尚未見文獻報道，微基生物可以開發(fā)程序，自行研發(fā)尋找目標菌株的特異基因并設(shè)計目標菌株的特異引物，驗證引物的特異性，進行后繼實驗。
微基生物已檢測過的物種信息，見表格（僅列出了常見的部分微生物種類），其他的微生物也可以檢測。
| 級別 | 中文名稱 | 英文名稱 |
| 界 | 細菌 | Bacteria |
| 界 | 真菌 | Fungi |
| 界 | 古菌 | Archaea |
| 門 | 放線菌門 | Actinobacteria |
| 門 | 擬桿菌門 | Bacteroidetes |
| 門 | 厚壁菌門 | Firmicutes |
| 綱 | alpha變形菌綱 | Alpha-proteobacteria |
| 綱 | gamma變形菌綱 | Gamma-proteobacteria |
| 科 | 腸桿菌科 | Enterobacteriaceae |
| 科 | 瘤胃球菌科 | Ruminococcaceae |
| 屬 | 雙歧桿菌屬 | Bifidobacterium |
| 屬 | 大腸桿菌屬 | Escherichia |
| 屬 | 乳酸桿菌屬 | Lactobacillus |
| 屬 | 梭菌屬 | Clostridium |
| 屬 | 腸球菌屬 | Enterococcus |
| 屬 | 擬桿菌屬 | Bacteroides |
| 屬 | 奇異菌屬 | Atopobium cluster |
| 屬 | 鏈球菌屬 | Streptococcus |
| 屬 | 瘤胃球菌屬 | Ruminococcus |
| 屬 | 糞桿菌屬 | Faecalibacterium |
| 屬 | 布勞特菌屬 | Blautia |
| 屬 | 艱難梭菌屬 | Clostridium difficile |
| 屬 | 脫硫弧菌屬 | Desulfovibrio |
| 屬 | 另支菌屬 | Alistipes |
| 屬 | 鏈球菌屬 | Streptococcus |
| 屬 | 薩特氏菌屬 | Sutterella |
| 屬 | 丙酸桿菌屬 | Propionibacterium |
| 屬 | 假單胞菌屬 | Pseudomonas |
| 屬 | 噬酸菌屬 | Acidovorax |
| 屬 | 不動桿菌屬 | Acinetobacter |
| 屬 | 鞘氨醇單胞菌屬 | Sphingomonas |
| 屬 | 分枝桿菌屬 | Mycobacterium |
| 屬 | 普氏菌屬 | Prevotella |
| 種 | 溶纖維丁酸弧菌 | Butyrivibrio fibrisolvens |
| 種 | 蛋白溶解梭菌 | Clostridium proteoclasticum |
| 種 | 金黃色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus |
| 種 | 青春雙歧桿菌 | Bifidobacterium adolescentis |
| 種 | 鼠李糖乳桿菌 | Lactobacillus rhamnosus |
| 種 | 糞腸球菌 | Enterococcus faecalis |
| 種 | 呀卟啉單胞菌 | Porphyromonas gingivalis |
| 種 | 陰道加德納菌 | Gardnerella vaginalis |
| 種 | 鼠乳桿菌 | Lactobacillus murinus |
| 種 | 解淀粉芽孢桿菌 | Bacillus amyloliquefaciens |
| 種 | 芽孢桿菌 | Bacillus velezensis |
| 種 | Akkermansia muciniphila | |
| 種 | 釀酒酵母 | Saccharomyces cerevisiae |
| 株 | 唾液鏈球菌 K12 | Saliva streptococcs |
2 qPCR的原理
實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量（與內(nèi)參基因?qū)Ρ龋┗蚪^對定量（通過標準曲線對未知模板進行定量）的方法確定各個樣本的本底表達量。
3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構(gòu)象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
TaqMan探針法：
擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步
SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別
| 方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
|
SYBR GREEN法 |
高靈敏度，操作簡單，不影響酶促反應(yīng)，價格便宜 |
1與探針法相比，對引物特異性要求較高，需進行熔解曲線分析 2靈敏度相對較低。 |
|
TaqMan 探針法 |
1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時檢測幾種不同的熒光信號的產(chǎn)物 |
1探針價格較高 2需要不同引物的擴增效率一致，對引物的設(shè)計及擴增條件要求比較高 |
4 qPCR的實驗方法
| 實驗方法 | 原理 | 技術(shù)應(yīng)用 | 相關(guān)應(yīng)用 |
| 絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ) | 是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構(gòu)建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。 |
特定微生物的拷貝數(shù)檢測 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測 |
1臨床疾病診斷 2動物疾病檢測 3食品安全 4科學研究 5應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構(gòu)、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 |
| 相對定量(RelativeQuantification，RQ) | 測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。 |
樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 |
|
相對定量和絕對定量的數(shù)據(jù)計算方法
標準質(zhì)?？截悢?shù)計算：
每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質(zhì)粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產(chǎn)物相對分子質(zhì)量
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計算copies/g樣本）
相對定量的計算：
步驟1:內(nèi)參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因=△Ct
步驟2:其他樣本和對照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對照樣本=△△Ct
步驟3:使用公式計算：倍數(shù)變化=2-△△Ct
5 qPCR的實驗流程
6 qPCR檢測送樣要求
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 環(huán)境 | 土壤/沉積物/淤泥 | 1g | |
| 湖水/海水/河水 | 1L，用濾膜或離心富集 | 過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。 | |
| 污水 | 20ml | 若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳 ? | |
| 泥水混合樣 | 2ml | ||
| 空氣 | 根據(jù)實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。 | ||
| 發(fā)酵物 | 固體 2g，液體 20ml |
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 人體 | 糞便 | ≥3g | |
| 皮膚 | 5 個采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面積，反復(fù)刮取 20 次。 | |
| 生殖道 | 5 個采集拭子 | 采集陰道口內(nèi) 4cm 處分泌物， 每個拭子轉(zhuǎn) 3 圈。 | |
| 牙菌斑/舌苔 | 5 個采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | |
| 唾液 | 10ml | ||
| 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | ||
| 鼻腔 | 5 個采集拭子 | 采集鼻腔內(nèi)粘膜上的分泌物，轉(zhuǎn) 3 圈。 | |
| 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 對灌洗液進行離心富集。 | |
| 腸道/胃組織 |
5mm*5mm*3mm 3 塊 |
盡量多一取些。 | |
| 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。 | |
| 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿為宜。 | |
| 母乳 | 5mL | ||
| 動物 | 糞便 | ≥3g | 最少 0.05g。 |
|
盲腸/結(jié)腸/胃 組織 |
≥3g | 至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本 | |
| 腸道內(nèi)容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建議客戶自己取內(nèi)容物，可以用 PBS 沖洗。 |
提醒
1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化。
2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒
7 qPCR結(jié)果
標準曲線
擴增曲線
熔解曲線
定量結(jié)果
| 微基編號 | 拷貝數(shù) | 樣本稀釋倍數(shù) | 抽提樣本重量（g） | 基因組DNA體積（μL） | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本 | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本 |
| 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 |
| 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | ||
| 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | ||
| 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 |
| 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | ||
| 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | ||
| 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 |
| 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | ||
| 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | ||
| 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 |
| 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | ||
| 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | ||
| 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 |
| 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | ||
| 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
8 術(shù)語解釋
Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設(shè)定：PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實驗結(jié)束后需對qPCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴增產(chǎn)物逐漸解鏈，導致熒光強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產(chǎn)物Tm值不同，從而可對PCR的特異性進行鑒定。
9 參考文獻
1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌門擬桿菌門alpha變形菌gamma變形菌等）
2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）
3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（雙歧桿菌艱難梭菌大腸桿菌探針法）
4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多種菌的定量）
