特定功能基因檢測

 1 檢測對象

特定功能基因指的是具有某種特定作用的酶的編碼基因，通過對該酶的基因進行qPCR定量，來確定該基因在樣本中的拷貝數(shù)。
目前研究較多的主要是氮循環(huán)過程中每個反應的酶，碳循環(huán)，硫相關，砷相關的一些酶的拷貝數(shù)信息。

 氮循環(huán)相關

氮是生命體核酸與蛋白質必不可少的組成元素。氮素的生物地球化學循環(huán)(氮循環(huán))對生命的存在和持續(xù)有關鍵作用，本質上是微生物驅動的氮素轉化、利用及循環(huán)的過程。氮循環(huán)就是指N2、無機氮化合物、有機氮化合物在自然界中相互轉化過程的總和，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等等。
氮循環(huán)及相關基因如下圖和下表：

參與途徑		基因名稱
固氮	N2—NH4+	nifH	Nitrogenase	固氮酶
氨化作用	OrgN—NH4+	ureC	Glutamate dehydrogenase	谷氨酸脫氫酶
硝化作用	NH4+—NO2–	amoA	ammonia monooxygenase	氨單加氧酶
	NO2–—NO3–	nxrA	nitrite oxidoreductase	亞硝酸鹽氧化還原酶
反硝化作用	NO3–—NO2–	narG	nitrate reductase	硝酸鹽還原酶
	NO2–—NO	nirS/nirK	nitrite reductase	亞硝酸鹽還原酶
	NO—NO2	norB	nitric oxide reductase	氧化還原酶
	NO2—N2	nosZ	nitrous oxide reductase	氧化亞氮還原酶
厭氧氨氧化	NO2–—N2	hzo	Hydrazine oxidase	聯(lián)氨氧化酶
異化N還原到銨	NO3–—NO2–	napA	nitrate reductase	硝酸鹽還原酶
	NO2–—NH4+	nrfA	c-type cytochrome nitrite reductase	細胞色素c亞硝酸鹽還原酶

 碳循環(huán)相關

碳循環(huán)主要是碳素的固定和轉化過程，主要包括碳固定、甲烷產(chǎn)生、甲烷氧化。
自養(yǎng)微生物具有極強的環(huán)境適應性和固碳潛力。目前發(fā)現(xiàn)的5條主要生物固碳途徑中，卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)生物固定CO2的主要途徑，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是卡爾文循環(huán)中的關鍵酶，因此RubisCO及其編碼基因被許多學者用于不同生態(tài)環(huán)境中固碳微生物群落結構和多樣性的研究。
產(chǎn)甲烷菌是重要的環(huán)境微生物,在自然界的碳素循環(huán)中起重要作用。產(chǎn)甲烷菌是一類能夠將無機或有機化合物厭氧發(fā)酵轉化成甲烷和二氧化碳的古細菌。
甲烷氧化菌是甲烷進入大氣的重要屏障,利用它降低人為源向大氣排放的甲烷量,對于緩解全球溫室效應具有潛在價值.
碳循環(huán)過程和相關基因如圖和下表：

作用		基因名稱
碳相關	固碳	cbbL/cbbM	Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase	核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶
	產(chǎn)生甲烷	mcrA	methyl coenzyme M reduc-tase	甲基輔酶 M 還原酶
	甲烷氧化	pmoA	particulate methane monooxygenase	甲烷氧化單加氧酶

 硫相關和砷相關的檢測基因見下表：

作用		基因名稱
硫相關	硫酸鹽還原	dsrA	dissimilatory sulfite reductase	異化型亞硫酸鹽還原酶
		dsrB	dissimilatory sulfite reductase	異化型亞硫酸鹽還原酶
	硫氧化	soxB	Sulfur oxidation	硫氧化酶
砷相關	砷氧化	aioA	arsenite (As(III)) oxidase genes	亞砷酸鹽氧化酶基因
	砷呼吸還原	arrA	respiratory arsenate (As(V)) reductase genes	呼吸性砷酸鹽還原酶基因
	砷解毒還原	arsC	As(V)reductase genes	砷還原酶基因
	砷甲基化	arsM	As(III) methyltransferase genes	砷甲基轉移酶基因

 2 qPCR的原理

實時熒光定量PCR技術（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量（與內(nèi)參基因對比）或絕對定量（通過標準曲線對未知模板進行定量）的方法確定各個樣本的本底表達量。

 3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

TaqMan探針法：

擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別

方法	優(yōu)點	缺點
SYBR GREEN法	高靈敏度，操作簡單，不影響酶促反應，價格便宜	1與探針法相比，對引物特異性要求較高，需進行熔解曲線分析 2靈敏度相對較低。
TaqMan 探針法	1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時檢測幾種不同的熒光信號的產(chǎn)物	1探針價格較高 2需要不同引物的擴增效率一致，對引物的設計及擴增條件要求比較高

 4 qPCR的實驗方法

實驗方法	原理	技術應用	相關應用
絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。	特定微生物的拷貝數(shù)檢測 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測	1臨床疾病診斷 2動物疾病檢測 3食品安全 4科學研究 5應用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
相對定量(RelativeQuantification，RQ)	測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。	樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例

 相對定量和絕對定量的數(shù)據(jù)計算方法

標準質?？截悢?shù)計算：

每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產(chǎn)物相對分子質量
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計算copies/g樣本）

相對定量的計算：

步驟1:內(nèi)參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因=△Ct

步驟2:其他樣本和對照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對照樣本=△△Ct

步驟3:使用公式計算：倍數(shù)變化=2-△△Ct

 5 qPCR的實驗流程

 6 qPCR檢測送樣要求

	樣本類型	樣品量/例	備注
環(huán)境	土壤/沉積物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用濾膜或離心富集	過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。
	污水	20ml	若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳　?
	泥水混合樣	2ml
	空氣	根據(jù)實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。
	發(fā)酵物	固體 2g，液體 20ml

	樣本類型	樣品量/例	備注
人體	糞便	≥3g
	皮膚	5 個采集拭子	采集 5cm*5cm 面積，反復刮取 20 次。
	生殖道	5 個采集拭子	采集陰道口內(nèi) 4cm 處分泌物， 每個拭子轉 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 個采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 個采集拭子	采集鼻腔內(nèi)粘膜上的分泌物，轉 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	對灌洗液進行離心富集。
	腸道/胃組織	5mm*5mm*3mm 3 塊	盡量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿為宜。
	母乳	5mL
動物	糞便	≥3g	最少 0.05g。
	盲腸/結腸/胃 組織	≥3g	至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本
	腸道內(nèi)容物	≥3g	最少 0.05g。建議客戶自己取內(nèi)容物，可以用 PBS 沖洗。

提醒

1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉化。

2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR結果

標準曲線

擴增曲線

熔解曲線

定量結果

微基編號	拷貝數(shù)	樣本稀釋倍數(shù)	抽提樣本重量（g）	基因組DNA體積（μL）	原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本	原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 術語解釋

Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設定：PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實驗結束后需對qPCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴增產(chǎn)物逐漸解鏈，導致熒光強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產(chǎn)物Tm值不同，從而可對PCR的特異性進行鑒定。

 9 參考文獻

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