高宿主 DNA 殘留？ddPCR 輕松定量微生物

在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，準(zhǔn)確檢測和定量微生物對于了解疾病機(jī)制、制定治療方案至關(guān)重要。然而，當(dāng)組織樣本中存在高宿主DNA殘留時，傳統(tǒng)的定量方法，如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR），常常會受到宿主DNA的嚴(yán)重干擾，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。而數(shù)字滴液PCR（ddPCR）技術(shù)的出現(xiàn)，為解決這一難題提供了創(chuàng)新且有效的途徑。

ddPCR 檢測方法原理

ddPCR是一種基于PCR技術(shù)的核酸絕對定量分析方法。它將傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)混合物分割成數(shù)以萬計的納升級微滴，每個微滴中包含極少量的模板DNA分子以及完整的PCR反應(yīng)試劑。在PCR擴(kuò)增過程中，這些微滴相互獨(dú)立進(jìn)行反應(yīng)，互不干擾。最終通過熒光信號檢測每個微滴中是否含有目標(biāo)DNA分子。根據(jù)泊松分布原理，通過統(tǒng)計陽性微滴的數(shù)量，可以計算出原始樣本中目標(biāo)DNA分子的絕對濃度。

引物和探針的設(shè)計在ddPCR檢測中起著核心作用，是檢測成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。合理且精心設(shè)計的引物和探針，能夠顯著提升檢測的特異性和靈敏度，進(jìn)而更精準(zhǔn)地識別并檢測樣本中的目標(biāo)微生物。

ddPCR特異性菌種 屬引物/探針設(shè)計

微基生物憑借專業(yè)的生物信息學(xué)團(tuán)隊和先進(jìn)的生物信息學(xué)軟件及工具，嚴(yán)格遵循引物/探針設(shè)計原則，為客戶量身定制引物和探針。

序列分析：對客戶提供的目標(biāo)微生物或基因序列進(jìn)行全面分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫信息，深入研究目標(biāo)序列特征（GC含量、潛在二級結(jié)構(gòu)、與其他序列的同源性等）。

個性化設(shè)計：根據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)類型（科研檢測、環(huán)境監(jiān)測等）、樣本特性（高宿主DNA 殘留樣本、復(fù)雜微生物群落樣本等）以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ǘ繖z測、定性分析等），設(shè)計符合特定需求的引物和探針。

多輪優(yōu)化與驗(yàn)證：設(shè)計完成后，借助軟件模擬引物和探針在不同條件下與目標(biāo)序列的結(jié)合情況進(jìn)行多輪虛擬篩選和優(yōu)化。對設(shè)計好的引物和探針進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，調(diào)整優(yōu)化，確保其在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效果和檢測性能。

技術(shù)支持與服務(wù)：為客戶提供全方位技術(shù)支持，從引物/探針設(shè)計咨詢、實(shí)驗(yàn)方案制定到實(shí)驗(yàn)過程指導(dǎo)、結(jié)果分析解讀等，解答客戶在實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題。

高宿主DNA殘留樣本的類型及ddPCR應(yīng)用

高宿主DNA殘留樣本常見的樣本類型包括：組織樣本、糞便樣本、口腔拭子樣本、血液樣本、環(huán)境樣本以及食品樣本等。ddPCR技術(shù)憑借其高靈敏度、絕對定量能力和高特異性，提高了檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

液滴數(shù)字PCR (ddPCR)與定量PCR (qPCR)對比

文獻(xiàn)分享

1.腫瘤組織中的微生物檢測

文獻(xiàn)：Accuracy and Clinical Relevance of Intra-Tumoral Fusobacterium nucleatum Detection in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue by Droplet Digital PCR(ddPCR) in Colorectal Cancer.（2022年）

研究背景：Fusobacterium nucleatum（Fn）被認(rèn)為與結(jié)直腸癌的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)，是一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。然而，傳統(tǒng)的qPCR方法在檢測FFPE組織中的Fn時存在局限性，因此研究者探索了ddPCR技術(shù)在檢測FFPE組織中Fn的準(zhǔn)確性和臨床相關(guān)性。

研究方法：

1.使用ddPCR技術(shù)優(yōu)化檢測條件，包括退火溫度和靈敏度評估。

2.在139例CRC FFPE樣本中檢測Fn DNA，并與qPCR結(jié)果進(jìn)行比較。

3.評估ddPCR檢測Fn的準(zhǔn)確性，并分析其與臨床病理特征和分子特征的相關(guān)性。

研究結(jié)果：

1.ddPCR檢測Fn的檢測下限為2.7拷貝/反應(yīng)，能夠檢測到20.1%的CRC樣本為Fn高表達(dá)。

2.與qPCR相比，ddPCR檢測Fn的靈敏度更高，但兩者結(jié)果一致性較低。

3.Fn高表達(dá)與CRC的不良預(yù)后相關(guān)，包括腫瘤位置、分化程度、MSI狀態(tài)和BRAF突變等。

4.Kaplan-Meier生存分析顯示，ddPCR檢測到Fn高表達(dá)的患者生存率較低，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性。

ddPCR和qPCR檢測的Fn DNA的量，并基于中位數(shù)將樣本分為高和低/陰性兩組。ddPCR檢測到的Fn高樣本比例顯著高于qPCR。

ROC曲線評估ddPCR檢測Fn DNA的準(zhǔn)確性。ddPCR在檢測FFPE樣本中的Fn DNA時具有較高的敏感性和特異性。

結(jié)論：ddPCR是一種高靈敏度的檢測方法，能夠準(zhǔn)確檢測FFPE組織中的Fn DNA，并揭示其在CRC中的臨床相關(guān)性。ddPCR在常規(guī)CRC診斷中具有潛在應(yīng)用價值。

 

2.糞便樣本中的腸道微生物定量

文獻(xiàn)：Detecting and quantifying Veillonella by real-time quantitative PCR and droplet digital PCR.（2024年）

研究背景：Veillonella屬細(xì)菌是革蘭氏陰性機(jī)會性病原體，與多種疾病（如牙周炎、炎癥性腸病和泌尿系感染）密切相關(guān)。研究者設(shè)計了一種基于16S rRNA基因序列的引物和探針，通過qPCR和ddPCR技術(shù)定量檢測糞便樣本中的Veillonella豐度。

研究方法：

1.基于16S rRNA基因序列設(shè)計引物和探針，進(jìn)行qPCR和ddPCR檢測。

2.使用模擬臨床樣本測試兩種方法的特異性和靈敏度。

3.收集炎癥性腸病（IBD）患者的臨床樣本，驗(yàn)證檢測系統(tǒng)的有效性。

研究結(jié)果：

1.qPCR的檢測靈敏度100拷貝/μL，能夠準(zhǔn)確檢測10³到10⁸CFU/mL的Veillonella濃度。

2.ddPCR的檢測靈敏度為11.3拷貝/μL，適合檢測10¹到10⁴CFU/mL的低豐度樣本。

3.臨床樣本中，qPCR和ddPCR的檢測結(jié)果與平板計數(shù)法一致，驗(yàn)證了檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

4.通過ddPCR檢測到的Veillonella種類包括V. dispar、V. nakazawae和V. rodentium。      

qPCR檢測Veillonella的特異性和靈敏度。qPCR的靈敏度100拷貝/μL，適用于檢測濃度范圍10³到10⁸CFU/mL的Veillonella樣本。

ddPCR檢測Veillonella的特異性和靈敏度。ddPCR的靈敏度11.3拷貝/μL，適用于檢測低豐度（10¹到10⁴CFU/mL）Veillonella樣本。

比較qPCR和ddPCR在檢測Veillonella時的能力差異。qPCR適用于高濃度樣本的檢測，而ddPCR更適合低濃度樣本的檢測。

比較qPCR和ddPCR在模擬臨床樣本（糞便樣本）中檢測Veillonella的能力。

結(jié)論：qPCR和ddPCR技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地檢測Veillonella，ddPCR尤其適用于低豐度樣本的檢測。

 

3.血液樣本中的病原體檢測

文獻(xiàn)：Sensitive and rapid identification of pathogens by droplet digital PCR in a cohort of septic patients: a prospective diagnostic study.（2024年）

研究背景：膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房中死亡率較高的疾病之一，早期準(zhǔn)確的病原體檢測對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。研究者評估了ddPCR技術(shù)在膿毒癥患者中快速、靈敏地檢測病原體的診斷效能。

研究方法：

1.進(jìn)行前瞻性診斷研究，納入89名患者的100例膿毒癥發(fā)作。

2.使用ddPCR技術(shù)檢測血液樣本中的病原體，并與血培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較。

3.評估ddPCR的敏感性、特異性、檢測率和周轉(zhuǎn)時間（TAT）。

4.分析經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療對ddPCR診斷性能的影響，并對ddPCR的定量結(jié)果進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

研究結(jié)果：

1.ddPCR的總體敏感性為75.0%，特異性為69.7%，檢測率比血培養(yǎng)高出17%。

2.ddPCR的周轉(zhuǎn)時間為2.5小時，顯著快于血培養(yǎng)（中位數(shù)47.5小時）。

3.在經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療組和非經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療組中，ddPCR的敏感性和特異性無顯著差異。

4.ddPCR能夠檢測到多種抗菌藥物耐藥基因，且與血培養(yǎng)結(jié)果一致。

5.動態(tài)監(jiān)測顯示，ddPCR的定量結(jié)果與CRP和PCT水平的變化趨勢一致，表明其可用于膿毒癥的動態(tài)監(jiān)測。

ddPCR檢測的實(shí)驗(yàn)流程。ddPCR檢測的高效性和標(biāo)準(zhǔn)化，適合快速診斷膿毒癥患者的病原體。

 ddPCR和血培養(yǎng)檢測到的病原體分布。ddPCR檢測病原體種類和數(shù)量上優(yōu)于血培養(yǎng)，能夠更全面地識別膿毒癥患者的病原體。

結(jié)論：與血培養(yǎng)相比，ddPCR在膿毒癥患者中具有更高的病原體檢測敏感性，能夠快速提供病原體和耐藥信息，且其定量結(jié)果與炎癥指標(biāo)的變化趨勢一致，可作為膿毒癥患者病原體負(fù)荷的動態(tài)監(jiān)測工具。

 

ddPCR技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢，在高宿主DNA殘留樣本的微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。從腫瘤組織到糞便、血液樣本，再到復(fù)雜的環(huán)境樣本檢測，ddPCR在眾多場景下具有實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量檢測的潛力，能為微生物檢測提供有效的技術(shù)支持。

 

引用文獻(xiàn)

1. Datorre, J. G., et al. (2022). Accuracy and Clinical Relevance of Intra-Tumoral Fusobacterium nucleatum Detection in FFPE Tissue by ddPCR in Colorectal Cancer. Diagnostics, 12(1), 114.

2. Ding, Z., et al. (2024). Detecting and Quantifying Veillonella by Real-Time Quantitative PCR and Droplet Digital PCR. Applied Microbiology and Biotechnology, 108, 45.

3. Wu, Z., et al. (2024). Sensitive and Rapid Identification of Pathogens by Droplet Digital PCR in a Cohort of Septic Patients: A Prospective Diagnostic Study. Infectious Diseases, 56(10), 830-841.

4. Kokkoris, V., et al. (2021). Challenges Using Droplet Digital PCR for Environmental Samples. Applied Microbiology, 1, 74-88.