格微?甄選 菌種特異性16S FISH探針設(shè)計服務(wù)

細(xì)菌存在于根尖周炎牙髓病灶的組織切片中

格微®甄選  菌種特異性16S FISH探針設(shè)計服務(wù)

? 從946萬余條已知的全部16S數(shù)據(jù)庫中，評測目標(biāo)微生物全部可能的FISH探針，報告出具有高特異性的1條或2條FISH探針（雙特異性FISH探針），以及可能的錯配。    

? 如單條FISH探針，特異性不佳（很難精確到菌種），則評估雙FISH探針（兩條目標(biāo)區(qū)域獨立、不重合的16S FISH探針）的特異性情況，給出詳細(xì)的解讀報告。

? 介于23S已知序列條數(shù)約22.7萬條，只有16S已知序列1/10的數(shù)量，我們FISH探針的設(shè)計都基于16S序列開展。

微基生物盡力為客戶提供優(yōu)秀的細(xì)菌特異性探針為目標(biāo)，利用當(dāng)前較為完善的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)及自身開發(fā)的程序完成對16S序列數(shù)據(jù)庫全面篩選匹配，協(xié)助科研客戶挑選出特定菌種特異性優(yōu)秀的探針。咨詢電話：021-50763698。

細(xì)菌FISH檢測的原理

細(xì)菌FISH檢測是以微生物中較穩(wěn)定的rRNA (主要是16S和23S) 作為分析的目標(biāo)，以rRNA序列設(shè)計探針進(jìn)行雜交，對待檢測的微生物分布情況和特征性的微生物進(jìn)行鑒定與定量分析，提供微生物形態(tài)學(xué)、空間分布和生物體的細(xì)胞數(shù)量等信息。

FISH雜交模式圖            新型寡聚核苷酸熒光原位雜交：發(fā)展與應(yīng)用 2023年

樣本類型

糞便、土壤、水樣、昆蟲、植物根部、口腔唾液、腫瘤組織等

 

FISH探針設(shè)計、評估報告

1.單探針效果很好，乙方提供單探針設(shè)計、項目報告。提供探針。

Dubosiella newyorkensis 單探針特異性較好

目標(biāo)物種名稱：Dubosiella newyorkensis，屬于目標(biāo)物種的16S序列有2條（下稱目標(biāo)16S序列庫），Dubosiella的物種有310條，屬于非目標(biāo)物種的序列有1796188條（下稱非目標(biāo)序列庫）。

單探針在庫中匹配情況統(tǒng)計：

p1_目標(biāo)mismatch0_count	p1_目標(biāo)mismatch1_count	p1_目標(biāo)mismatch2_count	p1_目標(biāo)mismatch3_count	p1_目標(biāo)mismatch0_percent	p1_目標(biāo)mismatch1_percent	p1_目標(biāo)mismatch2_percent	p1_目標(biāo)mismatch3_percent
2	2	2	2	100	100	100	100

 

2.單探針效果不好，乙方在設(shè)計過程中自動升級提供雙探針設(shè)計、項目報告。提供探針。 

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi  單探針設(shè)計不好，雙探針顯著改善。

目標(biāo)物種名稱：Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi，屬于目標(biāo)物種的16S序列有96條（下稱目標(biāo)16S序列庫），Salmonella enterica的物種有1792條，屬于非目標(biāo)物種的序列有1796094條（下稱非目標(biāo)序列庫）。

設(shè)計的第一條探針在庫中匹配情況統(tǒng)計：

p1_非目標(biāo)mismatch0_count	p1_非目標(biāo) mismatch1_count	p1_非目標(biāo) mismatch2_count	p1_非目標(biāo) mismatch3_count
3453	6317	9039	10828

 

p1_目標(biāo)mismatch0_count	p1_目標(biāo)mismatch1_count	p1_目標(biāo)mismatch2_count	p1_目標(biāo)mismatch3_count	p1_目標(biāo)mismatch0_percent	p1_目標(biāo)mismatch1_percent	p1_目標(biāo)mismatch2_percent	p1_目標(biāo)mismatch3_percent
92	93	93	93	95.83333	96.875	96.875	96.875

 

設(shè)計的第二條探針在序列庫中匹配情況統(tǒng)計：

p2_非目標(biāo)mismatch0_count	p2_非目標(biāo) mismatch1_count	p2_非目標(biāo) mismatch2_count	p2_非目標(biāo) mismatch3_count
69282	85392	87251	89460

 

p2_目標(biāo)mismatch0_count	p2_目標(biāo)mismatch1_count	p2_目標(biāo)mismatch2_count	p2_目標(biāo)mismatch3_count	p2_目標(biāo)mismatch0_percent	p2_目標(biāo)mismatch1_percent	p2_目標(biāo)mismatch2_percent	p2_目標(biāo)mismatch3_ percent
95	95	95	95	98.95833	98.95833	98.95833	98.95833

 

兩條探針分別匹配數(shù)據(jù)庫后，共同擊中非目標(biāo)序列庫的序列條數(shù)：

p12_非目標(biāo) mismatch0_count	p12_非目標(biāo) mismatch1_count	p12_非目標(biāo) mismatch2_count	p12_非目標(biāo) mismatch3_count
3336	6187	8893	10694

說明：

1. p*n_非目標(biāo)mismatch*_count：探針prob1或2與非目標(biāo)序列庫進(jìn)行匹配，分別統(tǒng)計mismatch為0.1.2.3時的序列條數(shù)。

2.p*_start：探針prob1或2在16S序列上的起始位置。

3. p*_目標(biāo)mismatch*_count：探針prob1或2與目標(biāo)16S序列庫匹配的條數(shù)，分別統(tǒng)計mismatch為0.1.2.3時的序列條數(shù)。

4 .p*_目標(biāo)mismatch*_percent：探針prob1或2與目標(biāo)16S序列庫匹配序列條數(shù)對應(yīng)的百分比，分別統(tǒng)計mismatch為0.1.2.3時的序列條數(shù)的百分比。

建議：單條FISH探針特異性較差，如需提高特異性，建議合成第二條探針（標(biāo)記不同熒光），進(jìn)行雙FISH探針雜交檢測。

 

文獻(xiàn)解讀     一、特異性熒光原位雜交探針的設(shè)計

鼠李糖乳桿菌Probio-M9的特異性熒光原位雜交探針設(shè)計及應(yīng)用 2021

目的  為了研究特定菌株在宿主腸中的定植和精確定位，使用熒光原位雜交定位鼠李糖乳桿菌 Probio–M9。

實驗設(shè)計  

1.鼠李糖乳桿菌種水平特異性探針（Probe-16S）設(shè)計

根據(jù)現(xiàn)有的乳桿菌的基因組信息，篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段，根據(jù)鼠李糖乳桿菌的16S序列設(shè)計了特異性探針（5’-CGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACC-3’）， 并在5’端用6-羧基熒光素（6-FAM）熒光基團(tuán)修飾。雜交優(yōu)化后，使用鼠李糖乳桿菌的15個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15個代表性菌株測試了探針16S的特異性。

2.鼠李糖桿菌Probio-M9菌株水平特異性探針（Probe-SP）設(shè)計

根據(jù)現(xiàn)有乳酸桿菌的基因組信息，首先篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段，然后將鼠李糖乳桿菌不同菌株的基因組與Probio-M9菌株的基因組進(jìn)行比較和分析，以篩選特異性基因組片段?；谠撈?，設(shè)計了Probio-M9菌株的水平特異性探針（5′-CCAACTGACGCCTTCACTTCG）。 使用鼠李糖乳桿菌的15個代表性菌株和來自乳桿菌的相關(guān)屬的15個代表性菌株測試探針-SP 的特異性。

結(jié)果展示

本研究針對鼠李糖乳桿菌Probio-M9和其它相關(guān)物種的基因組序列，分別設(shè)計了種水平特異性探針（Probe-16S）和菌株水平特異性熒光原位雜交探針（Probe-SP），并通過對15株鼠李糖乳桿菌菌株和15株其它益生菌進(jìn)行探針特異性的驗證；同時結(jié)合熒光D-氨基酸（FDAA）代謝探針，在大鼠的腸道中檢測到鼠李糖乳桿菌Probio-M9的活細(xì)胞。本方法在在攝入鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株后可利用該探針檢測及定位宿主腸道內(nèi)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9， 為以后開發(fā)和利用Probio-M9提供更多的理論依據(jù)。

 

 

二、熒光原位雜交確定腫瘤內(nèi)微生物的存在

Intratumoural microbiome can predict the prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery 2023

實驗?zāi)康募皩嶒炘O(shè)計  使用熒光原位雜交法測定了腫瘤內(nèi)微生物組的存在，并用16S rDNA測序法研究了腫瘤和鄰近正常組織中的微生物群落分布。對配對組的微生物特征進(jìn)行了鑒別，并進(jìn)一步研究了它們與臨床特征的相關(guān)性。用肝型對腫瘤組織的微生物特征進(jìn)行分類，進(jìn)一步分析了肝型的獨立預(yù)后價值。

部分結(jié)果展示                     肝癌中存在微生物

為了揭示肝癌中微生物群的存在，使用UB388探針對腫瘤樣本進(jìn)行FISH檢測。

（圖A）通過檢測FISH信號證實了肝細(xì)胞癌中存在細(xì)菌。EUB388探針（紅色）和DAPI（藍(lán)色）染色的腫瘤樣品中細(xì)菌16S rRNA的FISH分析。

（圖B）表明一些FISH信號存在于CD8+細(xì)胞中，表明CD8+細(xì)胞中存在細(xì)菌。細(xì)菌16S rRNA與免疫細(xì)胞共染色。CD8+T細(xì)胞用粉色(B)標(biāo)記。

（圖C）CD68+巨噬細(xì)胞傾向于分布在瘤內(nèi)微生物更豐富的區(qū)域，提示瘤內(nèi)微生物組可能影響肝癌中巨噬細(xì)胞的浸潤。巨噬細(xì)胞用綠色(C)標(biāo)記。

腫瘤和鄰近正常組織中不同的微生物分布

對91名肝癌患者的腫瘤樣本和鄰近樣本進(jìn)行檢查。肝細(xì)胞癌(HCC)腫瘤和鄰近正常組織中微生物組的表征。

（圖A）а-多樣性顯示腫瘤和鄰近組織之間沒有顯著差異（p=0.436）。

（圖B）β多樣性揭示了腫瘤組和正常組之間的顯著差異（p<0.001）。

（圖C）PLS-DA揭示了兩組之間的多樣性。四個細(xì)菌門（變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和奇球菌-棲熱菌門）占序列的90%。

（圖D）四個門在腫瘤和鄰近正常組織中均占優(yōu)勢。

本實驗中使用熒光原位雜交確定了腫瘤內(nèi)微生物組的存在，具有特異性好、定位準(zhǔn)確、 檢測時間短，試驗周期短等的優(yōu)勢，更適于腫瘤樣本微生物多樣性的檢測。