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微基生物采用高通量測序、PCR-DGGE、實時熒光定量PCR等方法，對樣本中的DNA進行序列測定，并通過生信統(tǒng)計分析，對大量數(shù)據(jù)進行處理，揭示腸道中微生物的種類以及它們之間的相對豐度和進化關系，探討微生物多樣性，研究根系微生物與環(huán)境間的相關關系。
技術路線：
高通量分析流程
PCR-DGGE分析流程
檢測平臺：
微基生物擁有Illumina MiSeq、Ion PGM、Roche 454高通量測序分析，PacBio第三代高通量測序分析，PCR-DGGE變性梯度凝膠分析，實時熒光定量PCR（Real-time qPCR），克隆文庫等檢測平臺。
樣品采集：
微基生物為客戶提供樣品采集的配套工具，如采集盒、保存液、取樣勺和保存管等。
送樣要求：
樣品原樣
(1)樣品類型：根系微生物，新鮮取樣，凍存于-80℃
(2)樣品需求：≥2g
(3)樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸
DNA類型
(1) 樣品類型： DNA
(2) 樣品需求量：≥300ng
(3) 樣品濃度： ≥10ng/μL
(4) 樣品純度：OD260/280=1.8-2.0并確保DNA無降解
(5) 樣品保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用冰袋或干冰運輸
(6) 對于本種類型的樣品，我們在檢測完樣品的質量后，進行PCR擴增等后續(xù)試驗
生物信息與統(tǒng)計學服務：
生信分析項目
更多微生態(tài)方向研究和生物信息方面服務，請詳詢：400-660-9270
標題：運用PCR-DGGE和焦磷酸測序分析（Roche 454）對紅樹林濕地和根圍古菌的多樣性分析
研究領域：根系微生物
分析物種：古菌
研究區(qū)域：16S rRNA V4 and V5 regions
研究方法：PCR-DGGE和Roche 454
主要結果：
- 實驗DGGE結果
2.兩個PCO軸和展示了所有數(shù)據(jù)集58%的變種，（根圍上、中、下古菌菌群的展示）
3.采用重測樣對16S rRNA的樣本寬度和樣本測序豐富度曲線
4.運用RDP的分類器算法統(tǒng)計出古菌16S rRNA在三個不同地方的差異
5.根際微生物中不同地方占主導地位OUT的相關關系
6.被檢索到的古菌序列的具體分類
原文鏈接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22660713
參考文獻：
Pires, A. C., D. F. Cleary, A. Almeida, A. Cunha, S. Dealtry, L. C. Mendonca-Hagler, K. Smalla and N. C. Gomes (2012). “Denaturing gradient gel electrophoresis and barcoded pyrosequencing reveal unprecedented archaeal diversity in mangrove sediment and rhizosphere samples.” Appl Environ Microbiol 78(16): 5520-5528.
]]>對于微生物群落多樣性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq、Ion Torrent PGM等高通量測序平臺，對核糖體DNA高變區(qū)域，比如16S/18S/ITS等序列或功能基因，比如細菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸鹽還原菌的異化型亞硫酸鹽還原酶基因進行測序分析，揭示環(huán)境樣品中眾多不同類型微生物種類以及它們之間的相對豐度和進化關系。
Ion Torrent PGM
Illumina Miseq
測序原理：
MiSeq測序系統(tǒng)采用Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測序技術，集擴增、測序和數(shù)據(jù)分析的測序儀，每次運行能產(chǎn)生超過7 Gb的數(shù)據(jù)，循環(huán)時間短、測序準確，通過專利的可逆終止試劑方法對數(shù)百萬片段進行平行測序。當dNTP加入時，對熒光標記的終止子成像、切割、到下一個堿基的摻入。由于每個測序循環(huán)中四種可逆終止子結合的dNTP都存在，所以自然競爭讓摻入偏差最小化。根據(jù)每個循環(huán)的熒光信號測定直接檢出堿基，與其他技術相比大大降低了原始錯誤率和可靠的堿基檢出。
MiSeq新型測序流程：
制備文庫的DNA起始量可低至50 ng
簇生成和測序都在MiSeq上完成
最后在內置的儀器計算機上開展數(shù)據(jù)分析
平臺優(yōu)勢：
價格低
Miseq測序長度長約500bp
高通量測序產(chǎn)出高
全自動的工作流程
最精準的數(shù)據(jù)質量
應用領域：
靶向重測序 (Targeted Resequencing)
PCR擴增：基于Nextera的快速文庫制備（1.5小時）和36 bp測序
高度多重的擴增子測序 (Amplicon Sequencing)
雜交捕獲 (Hybrid Capture)
16S宏基因組 (16S Metagenomics)
克隆檢驗 (Clone Checking)
小基因組測序 (Small Genome Sequencing)
de novo測序
重測序
質粒測序
RNA測序 (RNA Sequencing)
小RNA測序
RNA-seq
文庫質控
調控
ChIP-seq
Roche 454
工作原理：?
454高通量測序是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。
工作流程：?
1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實驗目的，將基因組DNA/cDNA片段化處理至300-800bp間，經(jīng)末端修復與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA；
2、Emulsion PCR：單鏈DNA文庫被固定在DNA捕獲磁珠上，每個磁珠結合了一個獨立的單鏈DNA片斷。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序實驗；
3、測序反應：攜帶DNA片段的磁珠被放入PTP板中供測序反應使用。PTP孔的直徑（29um）確保每個孔只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，每個核苷酸依次流入開放的孔洞和DNA捕獲磁珠建。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學發(fā)光的信號，并被測序儀CCD照相機所捕獲；
4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時的運行當中可獲得100余萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學工具對測序數(shù)據(jù)進行分析，并應用于不同領域。
技術特點：?
- 速度快
- 測序讀長最長,平均400-500個堿基；
- 準確度高
- 一致性好
- 可以進行Pair－End測序研究；
應用范圍：
1、全基因組測序
2、比較基因組研究
3、轉錄組和基因調節(jié)研究
4、擴增產(chǎn)物分析
Ion Torrent PGM
應用領域：微生物基因組測序和重測序，靶基因目標（擴增子）區(qū)域重測序
擴展性：半導體芯片技術
簡捷：自然的生物化學原理
快速：2個小時完成測序
Ion Torrent Personal Genome Machine(個人操作基因組測序儀以下簡稱：PGM?)，相較其他測序技術，更簡單、經(jīng)濟和擴展性更好的測序平臺。PGM?臺式系統(tǒng)配合革新性的半導體芯片技術，使整個平臺具有極高的擴展性和快速完成測序的性能。
Ion Torrent技術通過專有的大規(guī)模并行半導體感應器，對DNA 復制時產(chǎn)生的離子流，實現(xiàn)直接和實時的檢測。當試劑通過集成的流體通路進入 Ion Torrent 半導體芯片中，密布于芯片上的反應孔立即成為上百萬個微反應體系。這種獨特的流體體系，微體系機械設計和半導體的技術組合，使我們得以快速直接的將遺傳信息翻譯成數(shù)碼的 DNA 測序結果，得到大量高質量的測序數(shù)據(jù)。
PGM?服務整合Ion Torrent 的半導體芯片、反應試劑盒、計算機服務器和數(shù)據(jù)分析套件為您提供最全面最優(yōu)質的測序服務。
PGM?更高通量，更大價值，其測序通量完全超過其他測序通量高出至少一個數(shù)量級。