PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）

普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳只能通過片段大小不同在同一濃度的膠上電泳遷移率不同而分離不同的DNA片段，對于片段大小接近或相同的DNA片段無法做到有效地分離；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即變性梯度凝膠電泳，是利用DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。

DGGE作為一種成熟的分子生物學技術被廣泛應用于環(huán)境科學（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、醫(yī)學（各種疾病治療前后，病變部位微生物的差異）、人體（鼻咽、口腔、黏膜、腸道）等領域進行微生物多樣性分析。

實驗流程圖：

實驗結果

實驗結果包括以下內(nèi)容

1 引物設計

以下是DGGE中常用的引物，我們將根據(jù)客戶的不同需求，進行針對性的引物設計。

?	引物	序列（5’-3’）
細菌 16S V3區(qū)擴增引物	357-F-GC	CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG
	518r	ATTACCGCGGCTGCTGG

?	引物	序列（5’-3’）
真核 18S V1-3區(qū)擴增引物	Euk1A	CTGGTTGATCCTGCCAG
	EukA516r-GC	CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC

2 基因組DNA抽提電泳檢測圖

針對客戶的樣本來源不同，我們針對性優(yōu)化不同的基因組抽提方法，已達到提取效果最佳。

　　說明：1-8為樣本所抽提基因組DNA，上樣量3uL；M為1kb Marker上數(shù)第一條帶為8 kb，中間的亮帶為3kb，濃度為30ng/uL，其余為10 ng/uL。

3 目的片段PCR檢測

　　說明：1-8為樣本，負為負對照（說明我們的實驗沒有污染，這對分子實驗是至關重要的），上樣量為5uL；M為DL2000 Marker，上樣量3uL。其中亮帶為20ng/uL，其余為10 ng/uL。
Reconditioning PCR：

　　第一輪PCR產(chǎn)物將會作為新的模板再進行少數(shù)循環(huán)的第二輪PCR擴增，這叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的過程中引物和模板之間的比例始終保持在較高的水平上，因此可以保證引物與模板之間的退火要優(yōu)先于不同模板之間的退火，消除異源雙鏈（Heteroduplex）污染對于PCR-DGGE圖譜的觀察和分析。

參考文獻：
　　(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
　　(2)不同外源擾動因素對腸道菌群組成結構影響的研究. 上海交通大學 2008 屆博士學位論文.

4 DGGE圖譜分析

　　4.1 DGGE膠圖和條形圖
?
　　4.2 戴斯相似性系數(shù)

?圖注：lane:代表樣品編號

　　4.3微生物多樣性指數(shù)

　　

4.4 UPGAM法進行樣品間的聚類分析圖

　　常見聚類分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
　　4.5微生物群落的多維定標分析

　　4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）

　　4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）

5 .主要膠條進行割膠

6 割膠條帶的DNA回收、二擴及TA克隆

6.1 二擴電泳檢測
　　分別取5 μL PCR產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如下圖所示

　　電泳檢測結果顯示：PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小正確，可進行膠回收。
6.2 膠回收
　　采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收 PCR 產(chǎn)物，取3 μL回收產(chǎn)物進行電泳檢測。
6.3 TA連接及轉化
　　PCR產(chǎn)物的克隆使用 BioLinker的pED-T載體試劑盒。
6.4 陽性克隆的篩選及測序
　　在平板上隨機挑取8個克隆搖菌，菌液進行M13檢測，挑取3個陽性克隆進行測序。

7 測序結果匯總

7.1 fasta文件
　　全部測序結果進行整理，去除載體序列，將其整理為fasta格式的序列文件，為后續(xù)分析做準備。

7.2克隆子一致性分析（Alignment比對）

一般每個條帶送三個克隆子進行測序，那么三個克隆子所測序列的一致性如何，我們通過clonemanager軟件進行序列性的分析，如果克隆子的測序結果完全一致，那么會以綠色的覆蓋形式表示，若是序列不一致，會是白色區(qū)域。如下圖所示：

7.3測序結果NCBI的Blast比對匯總表

條帶編號	克隆子編號	菌株名稱	GenBank序列號	最大相似度（%）	條帶占比（%）
1	3	Winogradskyella ulvae strain KMM 6390	NR_109172.1	91	67
	7	Polaribacter irgensii strain 23-P	NR_044733.1	99	33
2	4	Cyanothece sp. ATCC 51142 strain ATCC 51142	NR_074316.1	93	33
	5	Clostridium populeti strain 743A	NR_026103.1	99	33
	7	Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1062 strain HTCC1062	NR_074224.1	100	33
3	3	Paraprevotella clara YIT 11840	NR_041626.1	100	67
	8	Flavobacterium limicola strain ST-82	NR_024787.1	97	33
4	1	Bacteroides vulgatus ATCC 8482 strain ATCC 8482	NR_074515.1	100	100
5	1	Bacteroides fragilis YCH46 strain YCH46	NR_074839.1	99	100
6	1	Bacteroides gallinarum strain JCM 13658	NR_041448.1	98	100
7	1	Megamonas rupellensis strain FM1025	NR_044473.1	97	100

7.4測序結果的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

?DGGE技術的優(yōu)缺點

優(yōu)點：1. 高效，理論上可以分離開一個堿基差異的DNA片段。
　　　2. 方便，不用對樣品進行標記
　　　3. 快速，對于已知DGGE條件的樣品，可在短時間能獲取DGGE圖譜
　　　4. 直觀，DGGE圖譜可直觀的反應出樣品中個組分的豐富度
　　　5. 穩(wěn)定，DGGE作為一種成熟的技術，可重復性高
　　　6. 可多樣本同時分析，展現(xiàn)各樣本的差異
缺點：1. 僅能檢測樣本中的主要微生物，占總量1%以上的微生物才能被檢測到。
　　　2. DGGE只能對200-700bp的片段有效地分離，過大或者過小的片段分離效果都不是很好。
　　　3. 因為儀器數(shù)值有上限，對于某些某種主要菌株占比較大又要展現(xiàn)大部分條帶的樣品，通過DGGE圖譜不能很好的反映出各個菌株的豐富度。
　　　4. 不同序列的DNA有可能發(fā)生共遷移而導致某些條帶會有多種不同的DNA片段
　　　5. 因為某些物種的基因不同拷貝之間存在異質性，即使一個堿基的差別都會使他們分開，而導致不同的條帶是相同物種。
　　　6. DGGE技術對微生物的分類鑒定依賴于基因數(shù)據(jù)庫,若數(shù)據(jù)庫中基因序列信息不夠豐富,將會限制DGGE的使用。
　　　7. 由于某些種類的16S rDNA不同拷貝之間的多態(tài)性問題,可能導致自然群落中細菌數(shù)量的過多估計。

送樣要求

1 、環(huán)境樣品基因組DNA

　　1） 請?zhí)峁舛却笥?0ng/uL，總量大于500ng的基因組DNA，DNA純度較差或降解嚴重會影響后繼的擴增實驗。如果方便的話，可提供電子版DNA電泳檢測照片及OD260/280比值。
　　2） 樣品在保存期間避免反復凍融。
　　3） 送樣務必標清楚樣品編號，并用parafilm膜對管口進行密封。
　　4）請務必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。

2、 環(huán)境樣品

　　1）送樣樣品盡量保證新鮮，為了防止微生物死亡或DNA降解，采樣后建議立即冰凍保存，如樣本極為珍貴，建議采用液氮速凍后-80℃冰箱保存。
　　2）樣品在保存期間避免反復凍融。
　　3）若是樣品中含有大量的腐殖質酸、重金屬等PCR反應抑制劑，請在送樣時注明。
　　4）請務必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。
送樣條件：
以上兩種類型的樣本，送樣時采用干冰保存運輸；若是距離較遠，建議采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。

3、各類未抽提基因組樣品的送樣量：

　　土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、農(nóng)田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
　　糞便：3-5 g
　　腸道內(nèi)容物：3-5 g
　　動物組織：3-5g（鰓、胃粘膜、腸粘膜、口腔黏膜等）
　　分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
　　水樣：2L以上水過濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當減少水的體積。
　　植物內(nèi)生菌：10-20g葉片；3-5g根系。
　　血液：10mL。
　　葉片：50-100g
　　其他來源的樣品請垂詢：400-660-9270或郵件：support@tinygene.com,我們會在第一時間回復您！
　　以上用PP材料的epp管或螺口管盛裝即可。