對于微生物群落多樣性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq、Ion Torrent PGM等高通量測序平臺，對核糖體DNA高變區(qū)域，比如16S/18S/ITS等序列或功能基因，比如細菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸鹽還原菌的異化型亞硫酸鹽還原酶基因進行測序分析，揭示環(huán)境樣品中眾多不同類型微生物種類以及它們之間的相對豐度和進化關系。
Ion Torrent PGM
Illumina Miseq
測序原理：
MiSeq測序系統(tǒng)采用Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測序技術，集擴增、測序和數(shù)據(jù)分析的測序儀，每次運行能產生超過7 Gb的數(shù)據(jù)，循環(huán)時間短、測序準確，通過專利的可逆終止試劑方法對數(shù)百萬片段進行平行測序。當dNTP加入時，對熒光標記的終止子成像、切割、到下一個堿基的摻入。由于每個測序循環(huán)中四種可逆終止子結合的dNTP都存在，所以自然競爭讓摻入偏差最小化。根據(jù)每個循環(huán)的熒光信號測定直接檢出堿基，與其他技術相比大大降低了原始錯誤率和可靠的堿基檢出。
MiSeq新型測序流程：
制備文庫的DNA起始量可低至50 ng
簇生成和測序都在MiSeq上完成
最后在內置的儀器計算機上開展數(shù)據(jù)分析
平臺優(yōu)勢：
價格低
Miseq測序長度長約500bp
高通量測序產出高
全自動的工作流程
最精準的數(shù)據(jù)質量
應用領域：
靶向重測序 (Targeted Resequencing)
PCR擴增：基于Nextera的快速文庫制備（1.5小時）和36 bp測序
高度多重的擴增子測序 (Amplicon Sequencing)
雜交捕獲 (Hybrid Capture)
16S宏基因組 (16S Metagenomics)
克隆檢驗 (Clone Checking)
小基因組測序 (Small Genome Sequencing)
de novo測序
重測序
質粒測序
RNA測序 (RNA Sequencing)
小RNA測序
RNA-seq
文庫質控
調控
ChIP-seq
Roche 454
工作原理：?
454高通量測序是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。
工作流程：?
1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實驗目的，將基因組DNA/cDNA片段化處理至300-800bp間，經末端修復與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA；
2、Emulsion PCR：單鏈DNA文庫被固定在DNA捕獲磁珠上，每個磁珠結合了一個獨立的單鏈DNA片斷。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序實驗；
3、測序反應：攜帶DNA片段的磁珠被放入PTP板中供測序反應使用。PTP孔的直徑（29um）確保每個孔只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，每個核苷酸依次流入開放的孔洞和DNA捕獲磁珠建。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產生化學發(fā)光的信號，并被測序儀CCD照相機所捕獲；
4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時的運行當中可獲得100余萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學工具對測序數(shù)據(jù)進行分析，并應用于不同領域。
技術特點：?
- 速度快
- 測序讀長最長,平均400-500個堿基；
- 準確度高
- 一致性好
- 可以進行Pair－End測序研究；
應用范圍：
1、全基因組測序
2、比較基因組研究
3、轉錄組和基因調節(jié)研究
4、擴增產物分析
Ion Torrent PGM
應用領域：微生物基因組測序和重測序，靶基因目標（擴增子）區(qū)域重測序
擴展性：半導體芯片技術
簡捷：自然的生物化學原理
快速：2個小時完成測序
Ion Torrent Personal Genome Machine(個人操作基因組測序儀以下簡稱：PGM?)，相較其他測序技術，更簡單、經濟和擴展性更好的測序平臺。PGM?臺式系統(tǒng)配合革新性的半導體芯片技術，使整個平臺具有極高的擴展性和快速完成測序的性能。
Ion Torrent技術通過專有的大規(guī)模并行半導體感應器，對DNA 復制時產生的離子流，實現(xiàn)直接和實時的檢測。當試劑通過集成的流體通路進入 Ion Torrent 半導體芯片中，密布于芯片上的反應孔立即成為上百萬個微反應體系。這種獨特的流體體系，微體系機械設計和半導體的技術組合，使我們得以快速直接的將遺傳信息翻譯成數(shù)碼的 DNA 測序結果，得到大量高質量的測序數(shù)據(jù)。
PGM?服務整合Ion Torrent 的半導體芯片、反應試劑盒、計算機服務器和數(shù)據(jù)分析套件為您提供最全面最優(yōu)質的測序服務。
PGM?更高通量，更大價值，其測序通量完全超過其他測序通量高出至少一個數(shù)量級。
實時熒光定量PCR（RT-qPCR），首發(fā)于微基生物。
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原理
在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
特點
檢測儀器少，只用一臺儀器。
檢測時間短，只須45分鐘～1小時10分鐘（試劑各異），而定性PCR須3～4小時，酶免終點定量須6～8小時，熒光終點定量須2～3小時。
操作極其簡單：前處理后，樣本插入儀器一小時后到電腦上來出報告即可，無須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。
結果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點定量PCR由于只能在40個熱循環(huán)結束后檢測熒光，被測熒光達到飽和導致定量不夠精確，屬于半定量狀態(tài)。而實時熒光QPCR是在擴增的每時每刻連續(xù)檢測各樣本的熒光值的變化。
應用
基因擴增、檢測、定量分析； 擴增特異性分析；SNP分析；RFLP多態(tài)性分析；單/多基因表達研究；高通量基因表達譜研究。
微基生物其QPCR定量實驗流程：
1. 標準曲線的制作
標準曲線利用含有qPCR目的片段的質粒為標準基因，具體步驟如下：
（1） 選用克隆文庫中含有目標基因質粒的搖瓶培養(yǎng)；
根據(jù)客戶需求，構建標準質粒（16S/18S/ITS/功能基因）
（2）試劑盒提取質粒；
（3）測定質粒濃度；
（4）對質粒的拷貝數(shù)進行計算；
?。?）將質粒DNA進行10倍梯度系列稀釋制作標準樣品和待測樣品一起擴增，得出標準曲線；
（6）根據(jù)所得標準曲線計算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以基因拷貝數(shù)每μL為單位進行分析。
2、熒光定量
?。?）本研究通過熒光定量的方法細菌16S rRNA基因進行定量。引物選取->qPCR。
根據(jù)客戶需求設計的引物進行實驗
?。?）PCR擴增程序1
3、標準曲線繪制
4、樣品中拷貝數(shù)測定
實時熒光定量PCR（RT-qPCR），首發(fā)于微基生物。
]]>PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳），首發(fā)于微基生物。
]]>DGGE作為一種成熟的分子生物學技術被廣泛應用于環(huán)境科學（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、醫(yī)學（各種疾病治療前后，病變部位微生物的差異）、人體（鼻咽、口腔、黏膜、腸道）等領域進行微生物多樣性分析。
實驗流程圖：
實驗結果
實驗結果包括以下內容
1 引物設計
以下是DGGE中常用的引物，我們將根據(jù)客戶的不同需求，進行針對性的引物設計。
| ? | 引物 | 序列（5’-3’） |
| 細菌 16S V3區(qū)擴增引物 |
357-F-GC | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG |
| 518r | ATTACCGCGGCTGCTGG |
| ? | 引物 | 序列（5’-3’） |
| 真核 18S V1-3區(qū)擴增引物 |
Euk1A | CTGGTTGATCCTGCCAG |
| EukA516r-GC | CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC |
2 基因組DNA抽提電泳檢測圖
針對客戶的樣本來源不同，我們針對性優(yōu)化不同的基因組抽提方法，已達到提取效果最佳。
說明：1-8為樣本所抽提基因組DNA，上樣量3uL；M為1kb Marker上數(shù)第一條帶為8 kb，中間的亮帶為3kb，濃度為30ng/uL，其余為10 ng/uL。
3 目的片段PCR檢測
說明：1-8為樣本，負為負對照（說明我們的實驗沒有污染，這對分子實驗是至關重要的），上樣量為5uL；M為DL2000 Marker，上樣量3uL。其中亮帶為20ng/uL，其余為10 ng/uL。
Reconditioning PCR：
第一輪PCR產物將會作為新的模板再進行少數(shù)循環(huán)的第二輪PCR擴增，這叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的過程中引物和模板之間的比例始終保持在較高的水平上，因此可以保證引物與模板之間的退火要優(yōu)先于不同模板之間的退火，消除異源雙鏈（Heteroduplex）污染對于PCR-DGGE圖譜的觀察和分析。
參考文獻：
(1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research.
(2)不同外源擾動因素對腸道菌群組成結構影響的研究. 上海交通大學 2008 屆博士學位論文.
4 DGGE圖譜分析
4.1 DGGE膠圖和條形圖
?
4.2 戴斯相似性系數(shù)
?圖注：lane:代表樣品編號
4.3微生物多樣性指數(shù)
4.4 UPGAM法進行樣品間的聚類分析圖
常見聚類分析方法有Neighbor Joining、single linkage、complete linkage、upgama、wpgama、centroid、median、ward’s
4.5微生物群落的多維定標分析
4.6 主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）
4.7 冗余分析（RDA, Redundancy Analysis）
5 .主要膠條進行割膠
6 割膠條帶的DNA回收、二擴及TA克隆
6.1 二擴電泳檢測
分別取5 μL PCR產物，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如下圖所示
電泳檢測結果顯示：PCR產物條帶單一，片段大小正確，可進行膠回收。
6.2 膠回收
采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收 PCR 產物，取3 μL回收產物進行電泳檢測。
6.3 TA連接及轉化
PCR產物的克隆使用 BioLinker的pED-T載體試劑盒。
6.4 陽性克隆的篩選及測序
在平板上隨機挑取8個克隆搖菌，菌液進行M13檢測，挑取3個陽性克隆進行測序。
7 測序結果匯總
7.1 fasta文件
全部測序結果進行整理，去除載體序列，將其整理為fasta格式的序列文件，為后續(xù)分析做準備。
7.2克隆子一致性分析（Alignment比對）
一般每個條帶送三個克隆子進行測序，那么三個克隆子所測序列的一致性如何，我們通過clonemanager軟件進行序列性的分析，如果克隆子的測序結果完全一致，那么會以綠色的覆蓋形式表示，若是序列不一致，會是白色區(qū)域。如下圖所示：
7.3測序結果NCBI的Blast比對匯總表
| 條帶編號 |
克隆子編號 |
菌株名稱 | GenBank序列號 | 最大相似度（%） | 條帶占比（%） |
| 1 | 3 | Winogradskyella ulvae strain KMM 6390 | NR_109172.1 | 91 | 67 |
| 7 | Polaribacter irgensii strain 23-P | NR_044733.1 | 99 | 33 | |
| 2 | 4 | Cyanothece sp. ATCC 51142 strain ATCC 51142 | NR_074316.1 | 93 | 33 |
| 5 | Clostridium populeti strain 743A | NR_026103.1 | 99 | 33 | |
| 7 | Candidatus Pelagibacter ubique HTCC1062 strain HTCC1062 | NR_074224.1 | 100 | 33 | |
| 3 | 3 | Paraprevotella clara YIT 11840 | NR_041626.1 | 100 | 67 |
| 8 | Flavobacterium limicola strain ST-82 | NR_024787.1 | 97 | 33 | |
| 4 | 1 | Bacteroides vulgatus ATCC 8482 strain ATCC 8482 | NR_074515.1 | 100 | 100 |
| 5 | 1 | Bacteroides fragilis YCH46 strain YCH46 | NR_074839.1 | 99 | 100 |
| 6 | 1 | Bacteroides gallinarum strain JCM 13658 | NR_041448.1 | 98 | 100 |
| 7 | 1 | Megamonas rupellensis strain FM1025 | NR_044473.1 | 97 | 100 |
7.4測序結果的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
?DGGE技術的優(yōu)缺點
優(yōu)點：1. 高效，理論上可以分離開一個堿基差異的DNA片段。
2. 方便，不用對樣品進行標記
3. 快速，對于已知DGGE條件的樣品，可在短時間能獲取DGGE圖譜
4. 直觀，DGGE圖譜可直觀的反應出樣品中個組分的豐富度
5. 穩(wěn)定，DGGE作為一種成熟的技術，可重復性高
6. 可多樣本同時分析，展現(xiàn)各樣本的差異
缺點：1. 僅能檢測樣本中的主要微生物，占總量1%以上的微生物才能被檢測到。
2. DGGE只能對200-700bp的片段有效地分離，過大或者過小的片段分離效果都不是很好。
3. 因為儀器數(shù)值有上限，對于某些某種主要菌株占比較大又要展現(xiàn)大部分條帶的樣品，通過DGGE圖譜不能很好的反映出各個菌株的豐富度。
4. 不同序列的DNA有可能發(fā)生共遷移而導致某些條帶會有多種不同的DNA片段
5. 因為某些物種的基因不同拷貝之間存在異質性，即使一個堿基的差別都會使他們分開，而導致不同的條帶是相同物種。
6. DGGE技術對微生物的分類鑒定依賴于基因數(shù)據(jù)庫,若數(shù)據(jù)庫中基因序列信息不夠豐富,將會限制DGGE的使用。
7. 由于某些種類的16S rDNA不同拷貝之間的多態(tài)性問題,可能導致自然群落中細菌數(shù)量的過多估計。
送樣要求
1 、環(huán)境樣品基因組DNA
1） 請?zhí)峁舛却笥?0ng/uL，總量大于500ng的基因組DNA，DNA純度較差或降解嚴重會影響后繼的擴增實驗。如果方便的話，可提供電子版DNA電泳檢測照片及OD260/280比值。
2） 樣品在保存期間避免反復凍融。
3） 送樣務必標清楚樣品編號，并用parafilm膜對管口進行密封。
4）請務必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。
2、 環(huán)境樣品
1）送樣樣品盡量保證新鮮，為了防止微生物死亡或DNA降解，采樣后建議立即冰凍保存，如樣本極為珍貴，建議采用液氮速凍后-80℃冰箱保存。
2）樣品在保存期間避免反復凍融。
3）若是樣品中含有大量的腐殖質酸、重金屬等PCR反應抑制劑，請在送樣時注明。
4）請務必填寫完整的送樣訂單，并用自封袋密封后同樣品一起送樣，以便收到樣品后妥善保存。
送樣條件：
以上兩種類型的樣本，送樣時采用干冰保存運輸；若是距離較遠，建議采用干冰加冰袋，存放于冰盒中。
3、各類未抽提基因組樣品的送樣量：
土壤：3-5 g（干沙土、干粘土、農田土、堆肥、底泥、泥炭土、淤泥等）
糞便：3-5 g
腸道內容物：3-5 g
動物組織：3-5g（鰓、胃粘膜、腸粘膜、口腔黏膜等）
分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
水樣：2L以上水過濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當減少水的體積。
植物內生菌：10-20g葉片；3-5g根系。
血液：10mL。
葉片：50-100g
其他來源的樣品請垂詢：400-660-9270或郵件：support@tinygene.com,我們會在第一時間回復您！
以上用PP材料的epp管或螺口管盛裝即可。
PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳），首發(fā)于微基生物。
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