關于特定種類的微生物，客戶可告知物種信息及引物信息，微基生物針對目標微生物進行qPCR定量分析；也可告知感興趣的物種名稱，微基生物來查詢相關引物信息；如老師感興趣的物種信息尚未見文獻報道，微基生物可以開發(fā)程序，自行研發(fā)尋找目標菌株的特異基因并設計目標菌株的特異引物，驗證引物的特異性，進行后繼實驗。
微基生物已檢測過的物種信息，見表格（僅列出了常見的部分微生物種類），其他的微生物也可以檢測。
| 級別 | 中文名稱 | 英文名稱 |
| 界 | 細菌 | Bacteria |
| 界 | 真菌 | Fungi |
| 界 | 古菌 | Archaea |
| 門 | 放線菌門 | Actinobacteria |
| 門 | 擬桿菌門 | Bacteroidetes |
| 門 | 厚壁菌門 | Firmicutes |
| 綱 | alpha變形菌綱 | Alpha-proteobacteria |
| 綱 | gamma變形菌綱 | Gamma-proteobacteria |
| 科 | 腸桿菌科 | Enterobacteriaceae |
| 科 | 瘤胃球菌科 | Ruminococcaceae |
| 屬 | 雙歧桿菌屬 | Bifidobacterium |
| 屬 | 大腸桿菌屬 | Escherichia |
| 屬 | 乳酸桿菌屬 | Lactobacillus |
| 屬 | 梭菌屬 | Clostridium |
| 屬 | 腸球菌屬 | Enterococcus |
| 屬 | 擬桿菌屬 | Bacteroides |
| 屬 | 奇異菌屬 | Atopobium cluster |
| 屬 | 鏈球菌屬 | Streptococcus |
| 屬 | 瘤胃球菌屬 | Ruminococcus |
| 屬 | 糞桿菌屬 | Faecalibacterium |
| 屬 | 布勞特菌屬 | Blautia |
| 屬 | 艱難梭菌屬 | Clostridium difficile |
| 屬 | 脫硫弧菌屬 | Desulfovibrio |
| 屬 | 另支菌屬 | Alistipes |
| 屬 | 鏈球菌屬 | Streptococcus |
| 屬 | 薩特氏菌屬 | Sutterella |
| 屬 | 丙酸桿菌屬 | Propionibacterium |
| 屬 | 假單胞菌屬 | Pseudomonas |
| 屬 | 噬酸菌屬 | Acidovorax |
| 屬 | 不動桿菌屬 | Acinetobacter |
| 屬 | 鞘氨醇單胞菌屬 | Sphingomonas |
| 屬 | 分枝桿菌屬 | Mycobacterium |
| 屬 | 普氏菌屬 | Prevotella |
| 種 | 溶纖維丁酸弧菌 | Butyrivibrio fibrisolvens |
| 種 | 蛋白溶解梭菌 | Clostridium proteoclasticum |
| 種 | 金黃色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus |
| 種 | 青春雙歧桿菌 | Bifidobacterium adolescentis |
| 種 | 鼠李糖乳桿菌 | Lactobacillus rhamnosus |
| 種 | 糞腸球菌 | Enterococcus faecalis |
| 種 | 呀卟啉單胞菌 | Porphyromonas gingivalis |
| 種 | 陰道加德納菌 | Gardnerella vaginalis |
| 種 | 鼠乳桿菌 | Lactobacillus murinus |
| 種 | 解淀粉芽孢桿菌 | Bacillus amyloliquefaciens |
| 種 | 芽孢桿菌 | Bacillus velezensis |
| 種 | Akkermansia muciniphila | |
| 種 | 釀酒酵母 | Saccharomyces cerevisiae |
| 株 | 唾液鏈球菌 K12 | Saliva streptococcs |
2 qPCR的原理
實時熒光定量PCR技術（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入可與DNA產物特異性結合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量（與內參基因對比）或絕對定量（通過標準曲線對未知模板進行定量）的方法確定各個樣本的本底表達量。
3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
TaqMan探針法：
擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步
SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別
| 方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
|
SYBR GREEN法 |
高靈敏度，操作簡單，不影響酶促反應，價格便宜 |
1與探針法相比，對引物特異性要求較高，需進行熔解曲線分析 2靈敏度相對較低。 |
|
TaqMan 探針法 |
1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時檢測幾種不同的熒光信號的產物 |
1探針價格較高 2需要不同引物的擴增效率一致，對引物的設計及擴增條件要求比較高 |
4 qPCR的實驗方法
| 實驗方法 | 原理 | 技術應用 | 相關應用 |
| 絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ) | 是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。 |
特定微生物的拷貝數(shù)檢測 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測 |
1臨床疾病診斷 2動物疾病檢測 3食品安全 4科學研究 5應用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 |
| 相對定量(RelativeQuantification，RQ) | 測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。 |
樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 |
|
相對定量和絕對定量的數(shù)據(jù)計算方法
標準質?？截悢?shù)計算：
每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產物相對分子質量
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計算copies/g樣本）
相對定量的計算：
步驟1:內參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內參基因=△Ct
步驟2:其他樣本和對照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對照樣本=△△Ct
步驟3:使用公式計算：倍數(shù)變化=2-△△Ct
5 qPCR的實驗流程
6 qPCR檢測送樣要求
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 環(huán)境 | 土壤/沉積物/淤泥 | 1g | |
| 湖水/海水/河水 | 1L，用濾膜或離心富集 | 過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。 | |
| 污水 | 20ml | 若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳 ? | |
| 泥水混合樣 | 2ml | ||
| 空氣 | 根據(jù)實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。 | ||
| 發(fā)酵物 | 固體 2g，液體 20ml |
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 人體 | 糞便 | ≥3g | |
| 皮膚 | 5 個采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面積，反復刮取 20 次。 | |
| 生殖道 | 5 個采集拭子 | 采集陰道口內 4cm 處分泌物， 每個拭子轉 3 圈。 | |
| 牙菌斑/舌苔 | 5 個采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | |
| 唾液 | 10ml | ||
| 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | ||
| 鼻腔 | 5 個采集拭子 | 采集鼻腔內粘膜上的分泌物，轉 3 圈。 | |
| 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 對灌洗液進行離心富集。 | |
| 腸道/胃組織 |
5mm*5mm*3mm 3 塊 |
盡量多一取些。 | |
| 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。 | |
| 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿為宜。 | |
| 母乳 | 5mL | ||
| 動物 | 糞便 | ≥3g | 最少 0.05g。 |
|
盲腸/結腸/胃 組織 |
≥3g | 至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本 | |
| 腸道內容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建議客戶自己取內容物，可以用 PBS 沖洗。 |
提醒
1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉化。
2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒
7 qPCR結果
標準曲線
擴增曲線
熔解曲線
定量結果
| 微基編號 | 拷貝數(shù) | 樣本稀釋倍數(shù) | 抽提樣本重量（g） | 基因組DNA體積（μL） | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本 | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本 |
| 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 |
| 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | ||
| 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | ||
| 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 |
| 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | ||
| 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | ||
| 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 |
| 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | ||
| 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | ||
| 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 |
| 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | ||
| 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | ||
| 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 |
| 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | ||
| 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
8 術語解釋
Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設定：PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J）設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實驗結束后需對qPCR產物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴增產物逐漸解鏈，導致熒光強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產物Tm值不同，從而可對PCR的特異性進行鑒定。
9 參考文獻
1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌門擬桿菌門alpha變形菌gamma變形菌等）
2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）
3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（雙歧桿菌艱難梭菌大腸桿菌探針法）
4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多種菌的定量）
]]>特定功能微生物多樣性分析，首發(fā)于微基生物。
]]>支配這些功能微生物發(fā)揮重要功能的基因被稱為功能基因，如amoA、dsrB、nxrA、nirK、mcrA、pmoA。目前微基生物已經完成了幾十種功能基因的檢測，具有成熟的檢測技術和分析經驗。
氮循環(huán)
氮是生命體核酸與蛋白質必不可少的組成元素。氮素的生物地球化學循環(huán)是土壤物質循環(huán)的重要組成部分，不僅影響土壤質量以及農田等環(huán)境系統(tǒng)的生產力和可持續(xù)性，還會影響全球環(huán)境變化。氮循環(huán)是指氮氣、無機氮化合物、有機氮化合物在自然界中相互轉化過程的總稱，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等。在不同的過程中，不同的功能基因起著不同的左右，常見的氮循環(huán)功能基因如下表所示：
|
基因名稱 |
編碼蛋白質 |
催化途徑 |
在氮循環(huán)中作用 |
|
nifH |
固氮酶鐵蛋白 |
N2–>NH4+ |
固氮作用 |
|
amoA |
氨單加氧酶 |
NH4+–> NO2– |
硝化作用 |
|
nxrA |
亞硝酸鹽氧化酶 |
NO2––> NO3– |
硝化作用 |
|
narG |
膜靠硝酸鹽還原酶 |
NO3––> NO2– |
反硝化作用 |
|
napA |
可溶性細胞質硝酸鹽還原酶 |
NO3––> NO2– |
反硝化作用 |
|
nirK |
含銅離子的亞硝酸鹽還原酶 |
NO2––> NO– |
反硝化作用 |
|
nirS |
含細胞色素cd1亞硝酸鹽還原酶 |
NO2––> NO– |
反硝化作用 |
|
norB |
NO 還原酶 |
NO–> N2O |
反硝化作用 |
|
nosZ |
N2O還原酶 |
N2O –> N2 |
反硝化作用 |
碳循環(huán)
結果展示
碳是生命物質的主要元素之一，是有機質的重要組成部分。碳元素在大氣、陸地、海洋等各大碳庫之間不斷循環(huán)變化。在大氣中，碳主要以CO2和CH4等氣體形式存在，在水中主要為碳酸根離子，在巖石圈中是碳酸鹽巖石和沉積物的主要成分，在陸地中則以各種有機物或無機物形式存在于植被和土壤中。碳循環(huán)中的主要功能基因如下表所示：
|
微生物名稱 |
基因名稱 |
編碼蛋白質 |
催化途徑 |
在碳循環(huán)中的作用 |
|
固碳微生物 |
cbbL |
固碳酶 RubisCO |
CO2àCH2O |
固碳作用 |
|
|
cbbM |
|
|
|
|
產甲烷菌 |
mcrA |
甲基輔酶M還原酶基因 |
CH2OàCH4 |
甲烷產生 |
|
甲烷氧化菌 |
pmoA |
甲烷單加氧酶基因 |
CH4àCO2 |
甲烷氧化 |
硫循環(huán)
硫是自然界中最豐富的元素之一，它以不同形式存在，這些不同形式的硫在微生物作用下，可以相互轉化，構成了硫的地球化學循環(huán)。
微生物在硫循環(huán)過程中的作用途徑主要有3條，1）是含硫有機物的脫硫作用，2）還原性無機硫的氧化作用力，3）硫酸鹽的還原作用。其中硫酸鹽還原菌（SRB）和硫氧化菌（SOB）是推動硫循環(huán)的重用微生物。常見的硫循環(huán)相關的功能基因有：
土壤硫循環(huán)中主要功能基因列表
|
微生物名稱 |
基因名稱 |
編碼蛋白質 |
催化途徑 |
在硫循環(huán)中的作用 |
|
硫酸鹽還原菌 |
dsrA |
異化型亞硫酸鹽還原酶 |
硫酸鹽à硫化氫 |
還原作用 |
|
硫酸鹽還原菌 |
dsrB |
異化型亞硫酸鹽還原酶 |
硫酸鹽à硫化氫 |
還原作用 |
|
硫氧化菌 |
soxB |
|
硫化物à硫酸 |
氧化作用 |
其他功能基因
功能微生物在自然界中積極的參與著地球化學循環(huán)。除了常見的碳循環(huán)、氮循環(huán)、硫循環(huán)功能微生物外，還有一些其他功能微生物起著重要的作用，比如參與磷循環(huán)微生物、厭氧氨氧化微生物等等。
微基生物積累了豐富的功能微生物檢測經驗，如果你有其他的功能基因要檢測，可以把功能基因文獻或引物發(fā)給我們，我們進行評估檢測。
檢測類型：
土壤、淤泥、水體等。
檢測方法：
二代高通量測序、實時熒光定量PCR。
樣本采集耗材：
為客戶提供樣本采集保存耗材，包括土壤樣本常溫保存液、取樣勺和保存管。
送樣要求：
土壤每樣本需1g，新鮮取樣，凍存于-80℃，保存期間切忌反復凍融，送樣時請使用干冰運輸；
若采用常溫采集保存耗材，常溫寄送即可。
海水、湖水等水樣建議一個樣本取500-1000ml，過濾0.22um濾膜，把濾膜放入無菌管，-80℃保存，干冰寄送。
如果是污水等，建議一個樣本取50-100ml，將樣本放入無菌管中，-80℃保存，干冰寄送。
如一個樣本檢測多個功能基因，取樣量建議咨詢技術支持。
技術路線：
生物信息分析流程
客戶發(fā)表文獻：
1：Hailu Wu, Xinze Wang, Xiaojuan He, et al. Effects of root exudates on denitrifier gene abundance, community structure and activity in a micro-polluted constructed wetland. Science of the Total Environment. 2017, 89:697-703.
2：Hailu Wu, Xinze Wang and XIaojun He. Effects of Selected Root Exudate Components on Nitrogen Removal and Development of Denitrifying Bacteria in Constructed Wetlands. Water. 2017, 9.
3: Congyan Wang, Jiawei Zhou, Jun Liu, et al. Responses of soil N-fixing bacteria communities to Amaranthus retroflexus invasion under different forms of N deposition. Agriculture, Ecosystems and Environment. 2017, 247: 329-336.
4：Congyan Wang, Kun Jiang, Jiawei Zhou, et al. Solidago canadensis invasion affects soil N-fixing bacterial communities in heterogeneous landscapes in urban ecosystems in East China. Science of The Total Environment. 2018,631: 702-713.
5：Cai Hui, Xiaoxiao Guo, Pengfei Sun, et al. Depth-specific distribution and diversity of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane-oxidizing bacteria in upland-cropping soil under different fertilizer treatments. Applied Soil Ecology. 2017, 113:117-126.
6：Xiaoming Lu, Pengzhen Lu and Ke Yang. Restoration using Azolla imbricata increases nitrogen functional bacterial groups and genes in soil. Applied Microbiology and Biotechnology. 2017,101: 3849-3859.
7: Sijie Wu, Ruili Li, Shuguang Xie, et al. Depth-related change of sulfate-reducing bacteria community in mangrove sediments: The influence of heavy metal contamination. Marine Pollution Bulletin.2019, 140:443-450.
8: Shuquan Peng, Fan Wang, Xibing Li, et al. A microbial method for improving salt swelling behavior of sulfate saline soil by an experimental study. Alexandria Engineering Journal. 2019, 58:1353-1366.
特定功能微生物多樣性分析，首發(fā)于微基生物。
]]>1 檢測樣本
糞便、水樣、土壤、霧霾、細菌等
若客戶提供DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉化。
2 檢測平臺
qPCR定量檢測平臺，能夠檢測300多種抗生素抗性基因。
3 檢測服務
絕對定量檢測服務：
是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。
相對定量檢測：
測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。
4 檢測方法
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
TaqMan探針法：
擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步
5 qPCR的實驗流程
6 部分基因列表如下：
| Gene | Classification | Mechanism |
| catA1、catB3、cfr等 | (flor)/(chlor)/(am)phenicol | deactivate |
| cmlA1、cmx(A)、floR等 | efflux | |
| qnrA等 | unknown | |
| aac、aacA/aphD、aacC、aacC1、aacC2、aacC4、aadA、aadD、aadE、aph、aph6ia、aphA1(akakanR)、spcN-01、spcN-02、str、strA、strB等 | Aminoglycosides | deactivate |
| ampC/blaDHA、ampC、bla1、blaCMY、blaCTX、blaGES、bla-L1、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXA1/blaOXA30、blaOXY、blaPAO、blaPER、blaPSE、blaROB、blaSFO、blaSHV-01、blaTEM、blaTLA、blaVEB、blaVIM、blaZ、cepA、cfiA、cfxA、cphA、fox5、NDM1、ampC等 | Beta_Lactamas | deactivate |
| mecA、pbp、pbp2x、Pbp5、penA等 | Beta_Lactamas | protection |
| int等 | MGEs | integrase |
| IS613、tnpA、Tp614等 | transposase | |
| ereB、lnuA、lnuB、lnuC、mphA、mphB、mphC、vatB、vatC、vatE、vgb、vgbB等 | MLSB | deactivate |
| carB、ImrA、matA/mel、mdtA、mefA、msrC、oleC、vgaA、vgbB、msrA等 | efflux | |
| erm、ermA、ermA/ermTR、ermB、ermC、ermF、ermJ/ermD、ermK、ermT、ermX、ermY等 | protection | |
| acrA、adeA、acrF、ceoA、cmeA、cmr、marR、mdetl1、mdtE/yhiU、mepA、mexA、mexD、mexE、mexF、mtrC、mtrD、oprD、oprJ、pmrA、qac、qacA、qacA/qacB、qacH、rarD、sdeB、tolC、ttgB、yceE/mdtG、yceL/mdtH、yidY/mdtL、ttgA、emrD等 | Multidrug | efflux |
| fabK、bacA、bacA、fosB、fosX、sat4等 | other | deactivate |
| imiR、nisB等 | unknown | |
| dfrA、folA等 | Sulfonamides | deactivate |
| sul等 | protection | |
| tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetPA、tet、tetV等 | Tetracyclines | efflux |
| tet(32)、tet(36)、tet(36)、tetM、tetO、tetW、tetPB、tetS、tetT、tetQ等 | protection | |
| tet(34)、tet(37)、tetU-01、tetX、tet(35)等 | unknown | |
| vanA、vanB、vanC、vanG、vanHB、vanHD、vanRA、vanRB、vanRC、vanRD、vanSA、vanSB、vanSC、vanTC、vanTE、vanTG、vanWB、vanWG、vanXA、vanXB、vanXD、vanYB、vanYD等 | Vancomycin | protection |
7 qPCR檢測送樣要求
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 環(huán)境 | 土壤/沉積物/淤泥 | 1g | |
| 湖水/海水/河水 | 1L，用濾膜或離心富集 | 過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。 | |
| 污水 | 20ml | 若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳 ? | |
| 泥水混合樣 | 2ml | ||
| 空氣 | 根據(jù)實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。 | ||
| 發(fā)酵物 | 固體 2g，液體 20ml |
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 人體 | 糞便 | ≥3g | |
| 皮膚 | 5 個采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面積，反復刮取 20 次。 | |
| 生殖道 | 5 個采集拭子 | 采集陰道口內 4cm 處分泌物， 每個拭子轉 3 圈。 | |
| 牙菌斑/舌苔 | 5 個采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | |
| 唾液 | 10ml | ||
| 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | ||
| 鼻腔 | 5 個采集拭子 | 采集鼻腔內粘膜上的分泌物，轉 3 圈。 | |
| 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 對灌洗液進行離心富集。 | |
| 腸道/胃組織 |
5mm*5mm*3mm 3 塊 |
盡量多一取些。 | |
| 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。 | |
| 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿為宜。 | |
| 母乳 | 5mL | ||
| 動物 | 糞便 | ≥3g | 最少 0.05g。 |
|
盲腸/結腸/胃 組織 |
≥3g | 至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本 | |
| 腸道內容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建議客戶自己取內容物，可以用 PBS 沖洗。 |
提醒
1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉化。
2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒
8 qPCR結果展示
標準曲線
擴增曲線
熔解曲線
定量結果
| 微基編號 | 拷貝數(shù) | 樣本稀釋倍數(shù) | 抽提樣本重量（g） | 基因組DNA體積（μL） | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本 | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本 |
| 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 |
| 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | ||
| 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | ||
| 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 |
| 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | ||
| 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | ||
| 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 |
| 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | ||
| 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | ||
| 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 |
| 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | ||
| 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | ||
| 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 |
| 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | ||
| 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
9 參考文獻
1ujin gDuan et.al. Gut resistomes, microbiota and antibiotic residues in Chinese patients undergoing antibiotic administration and healthyindividuals.2020. Science of the Total Environment.（研究中國健康人和患者）
抗生素濃度與ARG總豐度呈正相關，與ARG總豐度呈負相關ARGs和細菌群落的多樣性，這表明抗生素的使用可以形成抗生素耐藥性和腸道細菌群落。cfxA基因作為一種潛在的生物標志物，以區(qū)分在中國廣泛接受抗生素治療的患者和健康的個人在患者的腸道中檢測并顯著富集。
2JieFenget.al.Antibiotic Resistome in alarge-scale healthy human gut microbiota deciphered by metagenomic and network analyses.2017.Environmental microbiology.（不同國家的腸道微生物抗性基因分析）
中國人的腸道樣本中ermF、ermB、cfxA、tetQ的顯著富集，高于瑞典，可作為中國人中潛在的生物標志物。
特定功能基因指的是具有某種特定作用的酶的編碼基因，通過對該酶的基因進行qPCR定量，來確定該基因在樣本中的拷貝數(shù)。
目前研究較多的主要是氮循環(huán)過程中每個反應的酶，碳循環(huán)，硫相關，砷相關的一些酶的拷貝數(shù)信息。
氮循環(huán)相關
氮是生命體核酸與蛋白質必不可少的組成元素。氮素的生物地球化學循環(huán)(氮循環(huán))對生命的存在和持續(xù)有關鍵作用，本質上是微生物驅動的氮素轉化、利用及循環(huán)的過程。氮循環(huán)就是指N2、無機氮化合物、有機氮化合物在自然界中相互轉化過程的總和，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等等。
氮循環(huán)及相關基因如下圖和下表：
圖.png)
| 參與途徑 | 基因名稱 | |||
| 固氮 | N2—NH4+ | nifH | Nitrogenase | 固氮酶 |
| 氨化作用 | OrgN—NH4+ | ureC | Glutamate dehydrogenase | 谷氨酸脫氫酶 |
| 硝化作用 | NH4+—NO2– | amoA | ammonia monooxygenase | 氨單加氧酶 |
| NO2–—NO3– | nxrA | nitrite oxidoreductase | 亞硝酸鹽氧化還原酶 | |
| 反硝化作用 | NO3–—NO2– | narG | nitrate reductase | 硝酸鹽還原酶 |
| NO2–—NO | nirS/nirK | nitrite reductase | 亞硝酸鹽還原酶 | |
| NO—NO2 | norB | nitric oxide reductase | 氧化還原酶 | |
| NO2—N2 | nosZ | nitrous oxide reductase | 氧化亞氮還原酶 | |
| 厭氧氨氧化 | NO2–—N2 | hzo | Hydrazine oxidase | 聯(lián)氨氧化酶 |
| 異化N還原到銨 | NO3–—NO2– | napA | nitrate reductase | 硝酸鹽還原酶 |
| NO2–—NH4+ | nrfA |
c-type cytochrome nitrite reductase |
細胞色素c亞硝酸鹽還原酶 | |
碳循環(huán)相關
碳循環(huán)主要是碳素的固定和轉化過程，主要包括碳固定、甲烷產生、甲烷氧化。
自養(yǎng)微生物具有極強的環(huán)境適應性和固碳潛力。目前發(fā)現(xiàn)的5條主要生物固碳途徑中，卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)生物固定CO2的主要途徑，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是卡爾文循環(huán)中的關鍵酶，因此RubisCO及其編碼基因被許多學者用于不同生態(tài)環(huán)境中固碳微生物群落結構和多樣性的研究。
產甲烷菌是重要的環(huán)境微生物,在自然界的碳素循環(huán)中起重要作用。產甲烷菌是一類能夠將無機或有機化合物厭氧發(fā)酵轉化成甲烷和二氧化碳的古細菌。
甲烷氧化菌是甲烷進入大氣的重要屏障,利用它降低人為源向大氣排放的甲烷量,對于緩解全球溫室效應具有潛在價值.
碳循環(huán)過程和相關基因如圖和下表：
圖.png)
| 作用 | 基因名稱 | |||
| 碳相關 | 固碳 | cbbL/cbbM |
Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase |
核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶 |
| 產生甲烷 | mcrA | methyl coenzyme M reduc-tase | 甲基輔酶 M 還原酶 | |
| 甲烷氧化 | pmoA | particulate methane monooxygenase | 甲烷氧化單加氧酶 | |
硫相關和砷相關的檢測基因見下表：
| 作用 | 基因名稱 | |||
| 硫相關 | 硫酸鹽還原 | dsrA | dissimilatory sulfite reductase | 異化型亞硫酸鹽還原酶 |
| dsrB | dissimilatory sulfite reductase | 異化型亞硫酸鹽還原酶 | ||
| 硫氧化 | soxB | Sulfur oxidation | 硫氧化酶 | |
| 砷相關 | 砷氧化 | aioA | arsenite (As(III)) oxidase genes | 亞砷酸鹽氧化酶基因 |
| 砷呼吸還原 | arrA | respiratory arsenate (As(V)) reductase genes | 呼吸性砷酸鹽還原酶基因 | |
| 砷解毒還原 | arsC | As(V)reductase genes | 砷還原酶基因 | |
| 砷甲基化 | arsM | As(III) methyltransferase genes | 砷甲基轉移酶基因 | |
2 qPCR的原理
實時熒光定量PCR技術（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入可與DNA產物特異性結合的熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過相對定量（與內參基因對比）或絕對定量（通過標準曲線對未知模板進行定量）的方法確定各個樣本的本底表達量。
3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后構象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
TaqMan探針法：
擴增時加入一個特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步
SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別
| 方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
|
SYBR GREEN法 |
高靈敏度，操作簡單，不影響酶促反應，價格便宜 |
1與探針法相比，對引物特異性要求較高，需進行熔解曲線分析 2靈敏度相對較低。 |
|
TaqMan 探針法 |
1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時檢測幾種不同的熒光信號的產物 |
1探針價格較高 2需要不同引物的擴增效率一致，對引物的設計及擴增條件要求比較高 |
4 qPCR的實驗方法
| 實驗方法 | 原理 | 技術應用 | 相關應用 |
| 絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ) | 是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構建標準曲線對未知模板進行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。 |
特定微生物的拷貝數(shù)檢測 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測 |
1臨床疾病診斷 2動物疾病檢測 3食品安全 4科學研究 5應用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 |
| 相對定量(RelativeQuantification，RQ) | 測定目的基因在樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的絕對拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計算。 |
樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 |
|
相對定量和絕對定量的數(shù)據(jù)計算方法
標準質粒拷貝數(shù)計算：
每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產物相對分子質量
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計算copies/g樣本）
相對定量的計算：
步驟1:內參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內參基因=△Ct
步驟2:其他樣本和對照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對照樣本=△△Ct
步驟3:使用公式計算：倍數(shù)變化=2-△△Ct
5 qPCR的實驗流程
6 qPCR檢測送樣要求
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 環(huán)境 | 土壤/沉積物/淤泥 | 1g | |
| 湖水/海水/河水 | 1L，用濾膜或離心富集 | 過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進行富集。 | |
| 污水 | 20ml | 若樣本清亮則可適當?shù)囟嗳 ? | |
| 泥水混合樣 | 2ml | ||
| 空氣 | 根據(jù)實驗需要，用無菌濾膜過濾空氣。 | ||
| 發(fā)酵物 | 固體 2g，液體 20ml |
| 樣本類型 | 樣品量/例 | 備注 | |
| 人體 | 糞便 | ≥3g | |
| 皮膚 | 5 個采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面積，反復刮取 20 次。 | |
| 生殖道 | 5 個采集拭子 | 采集陰道口內 4cm 處分泌物， 每個拭子轉 3 圈。 | |
| 牙菌斑/舌苔 | 5 個采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | |
| 唾液 | 10ml | ||
| 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | ||
| 鼻腔 | 5 個采集拭子 | 采集鼻腔內粘膜上的分泌物，轉 3 圈。 | |
| 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 對灌洗液進行離心富集。 | |
| 腸道/胃組織 |
5mm*5mm*3mm 3 塊 |
盡量多一取些。 | |
| 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。 | |
| 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿為宜。 | |
| 母乳 | 5mL | ||
| 動物 | 糞便 | ≥3g | 最少 0.05g。 |
|
盲腸/結腸/胃 組織 |
≥3g | 至少 1g，如果實驗條件允許，盡可能多的收集樣本 | |
| 腸道內容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建議客戶自己取內容物，可以用 PBS 沖洗。 |
提醒
1 因為qPCR絕對定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時樣本的使用重量或是體積，方便后繼對數(shù)據(jù)進行轉化。
2 送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒
7 qPCR結果
標準曲線
擴增曲線
熔解曲線
定量結果
| 微基編號 | 拷貝數(shù) | 樣本稀釋倍數(shù) | 抽提樣本重量（g） | 基因組DNA體積（μL） | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA | 原始樣本目標基因拷貝數(shù)copies/g樣本 | 原始樣本目標基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本 |
| 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 |
| 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | ||
| 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | ||
| 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 |
| 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | ||
| 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | ||
| 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 |
| 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | ||
| 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | ||
| 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 |
| 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | ||
| 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | ||
| 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 |
| 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | ||
| 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
8 術語解釋
Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設定：PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J）設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實驗結束后需對qPCR產物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴增產物逐漸解鏈，導致熒光強度下降，到達某一溫度時，會導致大量的產物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產物Tm值不同，從而可對PCR的特異性進行鑒定。
9 參考文獻
1 Dan Chen et.al. Microbial community and metabolism activity in a bioelectrochemical denitrification system under long-term presence of p-nitrophenol.2018.Bioresource Technology.（narG nirK nirS napA）
2 Lei Wang et.al. Responses of bacterial and archaeal communities to nitrate stimulation after oil pollution in mangrove sediment revealed by Illumina sequencing.2016.Marine Pollution Bulletin.（nirK nirS）
3 Hailu Wu et.al . Effects of root exudates on denitrifier gene abundance, community structure and activity in a micro-polluted constructed wetland. 2017.ScienceoftheTotalEnvironment. （nirK nirS）
4 Suresh Kumar Dubeyet.al. Methane production potential and methanogenic archaeal community structure in tropical irrigated Indian paddy soils. 2014.Biol Fertil Soils.（mcrA）
5 Juanli Yun et.al. Diversity, abundance and vertical distribution of methane-oxidizing bacteria (methanotrophs) in the sediments of the Xianghai wetland, Songnen Plain, northeast China .2011.JSoilsSediments.（pmoA）
6 Hongxia Du et.al.Mercury-methylatinggenes dsrB and hgcA insoils/sedim entsofthe Three Gorges Reservoir.2016.Environment Scientifi cPollution Research.（dsrB）
7 Si-Yu Zhang et.al. Si-Yu Zhang Diversity and Abundance of Arsenic Biotransformation Genes in Paddy Soils from Southern China.2015. Enveronmental Science Technology.（砷相關基因）
]]>由于放線菌、雙歧桿菌對于人體健康有著重要的作用，因此許多研究人員對于腸道菌群中的放線菌、雙歧桿菌特別重視。但用檢測細菌通用引物（515F/ 926R）對放線菌進行高通量檢測時，檢出率較低，對于雙歧桿菌甚至檢測不出來。
微基生物經過查閱大量國際權威材料，經過優(yōu)化實驗條件，研發(fā)出專門針對放線菌的特異性引物，并通過改進、優(yōu)化序列的拼接程序，提高放線菌特別是雙歧桿菌的檢出率。
]]>