關(guān)于特定種類的微生物，客戶可告知物種信息及引物信息，微基生物針對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行qPCR定量分析；也可告知感興趣的物種名稱，微基生物來查詢相關(guān)引物信息；如老師感興趣的物種信息尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，微基生物可以開發(fā)程序，自行研發(fā)尋找目標(biāo)菌株的特異基因并設(shè)計(jì)目標(biāo)菌株的特異引物，驗(yàn)證引物的特異性，進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。
微基生物已檢測(cè)過的物種信息，見表格（僅列出了常見的部分微生物種類），其他的微生物也可以檢測(cè)。

級(jí)別	中文名稱	英文名稱
界	細(xì)菌	Bacteria
界	真菌	Fungi
界	古菌	Archaea
門	放線菌門	Actinobacteria
門	擬桿菌門	Bacteroidetes
門	厚壁菌門	Firmicutes
綱	alpha變形菌綱	Alpha-proteobacteria
綱	gamma變形菌綱	Gamma-proteobacteria
科	腸桿菌科	Enterobacteriaceae
科	瘤胃球菌科	Ruminococcaceae
屬	雙歧桿菌屬	Bifidobacterium
屬	大腸桿菌屬	Escherichia
屬	乳酸桿菌屬	Lactobacillus
屬	梭菌屬	Clostridium
屬	腸球菌屬	Enterococcus
屬	擬桿菌屬	Bacteroides
屬	奇異菌屬	Atopobium cluster
屬	鏈球菌屬	Streptococcus
屬	瘤胃球菌屬	Ruminococcus
屬	糞桿菌屬	Faecalibacterium
屬	布勞特菌屬	Blautia
屬	艱難梭菌屬	Clostridium difficile
屬	脫硫弧菌屬	Desulfovibrio
屬	另支菌屬	Alistipes
屬	鏈球菌屬	Streptococcus
屬	薩特氏菌屬	Sutterella
屬	丙酸桿菌屬	Propionibacterium
屬	假單胞菌屬	Pseudomonas
屬	噬酸菌屬	Acidovorax
屬	不動(dòng)桿菌屬	Acinetobacter
屬	鞘氨醇單胞菌屬	Sphingomonas
屬	分枝桿菌屬	Mycobacterium
屬	普氏菌屬	Prevotella
種	溶纖維丁酸弧菌	Butyrivibrio fibrisolvens
種	蛋白溶解梭菌	Clostridium proteoclasticum
種	金黃色葡萄球菌	Staphylococcus aureus
種	青春雙歧桿菌	Bifidobacterium adolescentis
種	鼠李糖乳桿菌	Lactobacillus rhamnosus
種	糞腸球菌	Enterococcus faecalis
種	呀卟啉單胞菌	Porphyromonas gingivalis
種	陰道加德納菌	Gardnerella vaginalis
種	鼠乳桿菌	Lactobacillus murinus
種	解淀粉芽孢桿菌	Bacillus amyloliquefaciens
種	芽孢桿菌	Bacillus velezensis
種		Akkermansia muciniphila
種	釀酒酵母	Saccharomyces cerevisiae
株	唾液鏈球菌 K12	Saliva streptococcs

 2 qPCR的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過相對(duì)定量（與內(nèi)參基因?qū)Ρ龋┗蚪^對(duì)定量（通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量）的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。

 3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后構(gòu)象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

TaqMan探針法：

擴(kuò)增時(shí)加入一個(gè)特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別

方法	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
SYBR GREEN法	高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，不影響酶促反應(yīng)，價(jià)格便宜	1與探針法相比，對(duì)引物特異性要求較高，需進(jìn)行熔解曲線分析 2靈敏度相對(duì)較低。
TaqMan 探針法	1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時(shí)檢測(cè)幾種不同的熒光信號(hào)的產(chǎn)物	1探針價(jià)格較高 2需要不同引物的擴(kuò)增效率一致，對(duì)引物的設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件要求比較高

 4 qPCR的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法	原理	技術(shù)應(yīng)用	相關(guān)應(yīng)用
絕對(duì)定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。	特定微生物的拷貝數(shù)檢測(cè) 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測(cè) 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測(cè)	1臨床疾病診斷 2動(dòng)物疾病檢測(cè) 3食品安全 4科學(xué)研究 5應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
相對(duì)定量(RelativeQuantification，RQ)	測(cè)定目的基因在樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的絕對(duì)拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計(jì)算。	樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例

 相對(duì)定量和絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算：

每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質(zhì)粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量
原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計(jì)算copies/g樣本）

相對(duì)定量的計(jì)算：

步驟1:內(nèi)參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因=△Ct

步驟2:其他樣本和對(duì)照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對(duì)照樣本=△△Ct

步驟3:使用公式計(jì)算：倍數(shù)變化=2-△△Ct

 5 qPCR的實(shí)驗(yàn)流程

 6 qPCR檢測(cè)送樣要求

	樣本類型	樣品量/例	備注
環(huán)境	土壤/沉積物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用濾膜或離心富集	過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進(jìn)行富集。
	污水	20ml	若樣本清亮則可適當(dāng)?shù)囟嗳　?
	泥水混合樣	2ml
	空氣	根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用無菌濾膜過濾空氣。
	發(fā)酵物	固體 2g，液體 20ml

	樣本類型	樣品量/例	備注
人體	糞便	≥3g
	皮膚	5 個(gè)采集拭子	采集 5cm*5cm 面積，反復(fù)刮取 20 次。
	生殖道	5 個(gè)采集拭子	采集陰道口內(nèi) 4cm 處分泌物， 每個(gè)拭子轉(zhuǎn) 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 個(gè)采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 個(gè)采集拭子	采集鼻腔內(nèi)粘膜上的分泌物，轉(zhuǎn) 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	對(duì)灌洗液進(jìn)行離心富集。
	腸道/胃組織	5mm*5mm*3mm 3 塊	盡量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿?yàn)橐恕?/span>
	母乳	5mL
動(dòng)物	糞便	≥3g	最少 0.05g。
	盲腸/結(jié)腸/胃 組織	≥3g	至少 1g，如果實(shí)驗(yàn)條件允許，盡可能多的收集樣本
	腸道內(nèi)容物	≥3g	最少 0.05g。建議客戶自己取內(nèi)容物，可以用 PBS 沖洗。

提醒

1 因?yàn)閝PCR絕對(duì)定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時(shí)樣本的使用重量或是體積，方便后繼對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2 送樣時(shí)請(qǐng)盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運(yùn)輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時(shí)放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線

擴(kuò)增曲線

熔解曲線

定量結(jié)果

微基編號(hào)	拷貝數(shù)	樣本稀釋倍數(shù)	抽提樣本重量（g）	基因組DNA體積（μL）	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/g樣本	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 術(shù)語解釋

Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設(shè)定：PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需對(duì)qPCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，到達(dá)某一溫度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產(chǎn)物Tm值不同，從而可對(duì)PCR的特異性進(jìn)行鑒定。

 9 參考文獻(xiàn)

1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌門擬桿菌門alpha變形菌gamma變形菌等）

2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）

3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（雙歧桿菌艱難梭菌大腸桿菌探針法）

4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多種菌的定量）

特定種類微生物檢測(cè)，首發(fā)于微基生物。

 1 檢測(cè)樣本

糞便、水樣、土壤、霧霾、細(xì)菌等 

若客戶提供DNA，建議客戶記錄抽提DNA時(shí)樣本的使用重量或是體積，方便后繼對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

 2 檢測(cè)平臺(tái)

qPCR定量檢測(cè)平臺(tái)，能夠檢測(cè)300多種抗生素抗性基因。

 3 檢測(cè)服務(wù)

絕對(duì)定量檢測(cè)服務(wù)：
是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。

相對(duì)定量檢測(cè)：
測(cè)定目的基因在樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的絕對(duì)拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計(jì)算。

 4 檢測(cè)方法

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后構(gòu)象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

TaqMan探針法：

擴(kuò)增時(shí)加入一個(gè)特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

 5 qPCR的實(shí)驗(yàn)流程

 6 部分基因列表如下：

Gene	Classification	Mechanism
catA1、catB3、cfr等	(flor)/(chlor)/(am)phenicol	deactivate
cmlA1、cmx(A)、floR等		efflux
qnrA等		unknown
aac、aacA/aphD、aacC、aacC1、aacC2、aacC4、aadA、aadD、aadE、aph、aph6ia、aphA1(akakanR)、spcN-01、spcN-02、str、strA、strB等	Aminoglycosides	deactivate
ampC/blaDHA、ampC、bla1、blaCMY、blaCTX、blaGES、bla-L1、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXA1/blaOXA30、blaOXY、blaPAO、blaPER、blaPSE、blaROB、blaSFO、blaSHV-01、blaTEM、blaTLA、blaVEB、blaVIM、blaZ、cepA、cfiA、cfxA、cphA、fox5、NDM1、ampC等	Beta_Lactamas	deactivate
mecA、pbp、pbp2x、Pbp5、penA等	Beta_Lactamas	protection
int等	MGEs	integrase
IS613、tnpA、Tp614等		transposase
ereB、lnuA、lnuB、lnuC、mphA、mphB、mphC、vatB、vatC、vatE、vgb、vgbB等	MLSB	deactivate
carB、ImrA、matA/mel、mdtA、mefA、msrC、oleC、vgaA、vgbB、msrA等		efflux
erm、ermA、ermA/ermTR、ermB、ermC、ermF、ermJ/ermD、ermK、ermT、ermX、ermY等		protection
acrA、adeA、acrF、ceoA、cmeA、cmr、marR、mdetl1、mdtE/yhiU、mepA、mexA、mexD、mexE、mexF、mtrC、mtrD、oprD、oprJ、pmrA、qac、qacA、qacA/qacB、qacH、rarD、sdeB、tolC、ttgB、yceE/mdtG、yceL/mdtH、yidY/mdtL、ttgA、emrD等	Multidrug	efflux
fabK、bacA、bacA、fosB、fosX、sat4等	other	deactivate
imiR、nisB等		unknown
dfrA、folA等	Sulfonamides	deactivate
sul等		protection
tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetJ、tetK、tetL、tetPA、tet、tetV等	Tetracyclines	efflux
tet(32)、tet(36)、tet(36)、tetM、tetO、tetW、tetPB、tetS、tetT、tetQ等		protection
tet(34)、tet(37)、tetU-01、tetX、tet(35)等		unknown
vanA、vanB、vanC、vanG、vanHB、vanHD、vanRA、vanRB、vanRC、vanRD、vanSA、vanSB、vanSC、vanTC、vanTE、vanTG、vanWB、vanWG、vanXA、vanXB、vanXD、vanYB、vanYD等	Vancomycin	protection

 7 qPCR檢測(cè)送樣要求

	樣本類型	樣品量/例	備注
環(huán)境	土壤/沉積物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用濾膜或離心富集	過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進(jìn)行富集。
	污水	20ml	若樣本清亮則可適當(dāng)?shù)囟嗳　?
	泥水混合樣	2ml
	空氣	根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用無菌濾膜過濾空氣。
	發(fā)酵物	固體 2g，液體 20ml

	樣本類型	樣品量/例	備注
人體	糞便	≥3g
	皮膚	5 個(gè)采集拭子	采集 5cm*5cm 面積，反復(fù)刮取 20 次。
	生殖道	5 個(gè)采集拭子	采集陰道口內(nèi) 4cm 處分泌物， 每個(gè)拭子轉(zhuǎn) 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 個(gè)采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 個(gè)采集拭子	采集鼻腔內(nèi)粘膜上的分泌物，轉(zhuǎn) 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	對(duì)灌洗液進(jìn)行離心富集。
	腸道/胃組織	5mm*5mm*3mm 3 塊	盡量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿?yàn)橐恕?/span>
	母乳	5mL
動(dòng)物	糞便	≥3g	最少 0.05g。
	盲腸/結(jié)腸/胃 組織	≥3g	至少 1g，如果實(shí)驗(yàn)條件允許，盡可能多的收集樣本
	腸道內(nèi)容物	≥3g	最少 0.05g。建議客戶自己取內(nèi)容物，可以用 PBS 沖洗。

提醒

1 因?yàn)閝PCR絕對(duì)定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時(shí)樣本的使用重量或是體積，方便后繼對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2 送樣時(shí)請(qǐng)盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運(yùn)輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時(shí)放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒

 8 qPCR結(jié)果展示

標(biāo)準(zhǔn)曲線

擴(kuò)增曲線

熔解曲線

定量結(jié)果

微基編號(hào)	拷貝數(shù)	樣本稀釋倍數(shù)	抽提樣本重量（g）	基因組DNA體積（μL）	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/g樣本	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 9 參考文獻(xiàn)

1ujin gDuan et.al. Gut resistomes, microbiota and antibiotic residues in Chinese patients undergoing antibiotic administration and healthyindividuals.2020. Science of the Total Environment.（研究中國健康人和患者）
抗生素濃度與ARG總豐度呈正相關(guān)，與ARG總豐度呈負(fù)相關(guān)ARGs和細(xì)菌群落的多樣性，這表明抗生素的使用可以形成抗生素耐藥性和腸道細(xì)菌群落。cfxA基因作為一種潛在的生物標(biāo)志物，以區(qū)分在中國廣泛接受抗生素治療的患者和健康的個(gè)人在患者的腸道中檢測(cè)并顯著富集。

2JieFenget.al.Antibiotic Resistome in alarge-scale healthy human gut microbiota deciphered by metagenomic and network analyses.2017.Environmental microbiology.（不同國家的腸道微生物抗性基因分析）
中國人的腸道樣本中ermF、ermB、cfxA、tetQ的顯著富集，高于瑞典，可作為中國人中潛在的生物標(biāo)志物。

抗性基因檢測(cè)，首發(fā)于微基生物。

特定功能基因指的是具有某種特定作用的酶的編碼基因，通過對(duì)該酶的基因進(jìn)行qPCR定量，來確定該基因在樣本中的拷貝數(shù)。
目前研究較多的主要是氮循環(huán)過程中每個(gè)反應(yīng)的酶，碳循環(huán)，硫相關(guān)，砷相關(guān)的一些酶的拷貝數(shù)信息。

 氮循環(huán)相關(guān)

氮是生命體核酸與蛋白質(zhì)必不可少的組成元素。氮素的生物地球化學(xué)循環(huán)(氮循環(huán))對(duì)生命的存在和持續(xù)有關(guān)鍵作用，本質(zhì)上是微生物驅(qū)動(dòng)的氮素轉(zhuǎn)化、利用及循環(huán)的過程。氮循環(huán)就是指N2、無機(jī)氮化合物、有機(jī)氮化合物在自然界中相互轉(zhuǎn)化過程的總和，包括氨化作用、硝化作用、反硝化作用、固氮作用等等。
氮循環(huán)及相關(guān)基因如下圖和下表：

參與途徑		基因名稱
固氮	N2—NH4+	nifH	Nitrogenase	固氮酶
氨化作用	OrgN—NH4+	ureC	Glutamate dehydrogenase	谷氨酸脫氫酶
硝化作用	NH4+—NO2–	amoA	ammonia monooxygenase	氨單加氧酶
	NO2–—NO3–	nxrA	nitrite oxidoreductase	亞硝酸鹽氧化還原酶
反硝化作用	NO3–—NO2–	narG	nitrate reductase	硝酸鹽還原酶
	NO2–—NO	nirS/nirK	nitrite reductase	亞硝酸鹽還原酶
	NO—NO2	norB	nitric oxide reductase	氧化還原酶
	NO2—N2	nosZ	nitrous oxide reductase	氧化亞氮還原酶
厭氧氨氧化	NO2–—N2	hzo	Hydrazine oxidase	聯(lián)氨氧化酶
異化N還原到銨	NO3–—NO2–	napA	nitrate reductase	硝酸鹽還原酶
	NO2–—NH4+	nrfA	c-type cytochrome nitrite reductase	細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶

 碳循環(huán)相關(guān)

碳循環(huán)主要是碳素的固定和轉(zhuǎn)化過程，主要包括碳固定、甲烷產(chǎn)生、甲烷氧化。
自養(yǎng)微生物具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和固碳潛力。目前發(fā)現(xiàn)的5條主要生物固碳途徑中，卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)生物固定CO2的主要途徑，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，因此RubisCO及其編碼基因被許多學(xué)者用于不同生態(tài)環(huán)境中固碳微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究。
產(chǎn)甲烷菌是重要的環(huán)境微生物,在自然界的碳素循環(huán)中起重要作用。產(chǎn)甲烷菌是一類能夠?qū)o機(jī)或有機(jī)化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的古細(xì)菌。
甲烷氧化菌是甲烷進(jìn)入大氣的重要屏障,利用它降低人為源向大氣排放的甲烷量,對(duì)于緩解全球溫室效應(yīng)具有潛在價(jià)值.
碳循環(huán)過程和相關(guān)基因如圖和下表：

作用		基因名稱
碳相關(guān)	固碳	cbbL/cbbM	Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase	核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶
	產(chǎn)生甲烷	mcrA	methyl coenzyme M reduc-tase	甲基輔酶 M 還原酶
	甲烷氧化	pmoA	particulate methane monooxygenase	甲烷氧化單加氧酶

 硫相關(guān)和砷相關(guān)的檢測(cè)基因見下表：

作用		基因名稱
硫相關(guān)	硫酸鹽還原	dsrA	dissimilatory sulfite reductase	異化型亞硫酸鹽還原酶
		dsrB	dissimilatory sulfite reductase	異化型亞硫酸鹽還原酶
	硫氧化	soxB	Sulfur oxidation	硫氧化酶
砷相關(guān)	砷氧化	aioA	arsenite (As(III)) oxidase genes	亞砷酸鹽氧化酶基因
	砷呼吸還原	arrA	respiratory arsenate (As(V)) reductase genes	呼吸性砷酸鹽還原酶基因
	砷解毒還原	arsC	As(V)reductase genes	砷還原酶基因
	砷甲基化	arsM	As(III) methyltransferase genes	砷甲基轉(zhuǎn)移酶基因

 2 qPCR的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過相對(duì)定量（與內(nèi)參基因?qū)Ρ龋┗蚪^對(duì)定量（通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量）的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。

 3 3種熒光試劑的工作原理及區(qū)別

SYBRGreenⅠ法：

嵌入到雙鏈DNA分子后在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后構(gòu)象發(fā)生變化，能夠吸收497nm的激發(fā)光并發(fā)出520nm的熒光；而不摻入DNA雙鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

TaqMan探針法：

擴(kuò)增時(shí)加入一個(gè)特異性的寡核苷酸熒光探針，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

 SYBRGREEN法和TaqMan探針法的區(qū)別

方法	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
SYBR GREEN法	高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，不影響酶促反應(yīng)，價(jià)格便宜	1與探針法相比，對(duì)引物特異性要求較高，需進(jìn)行熔解曲線分析 2靈敏度相對(duì)較低。
TaqMan 探針法	1具有高度特異性 2更高的靈敏度 3可同時(shí)檢測(cè)幾種不同的熒光信號(hào)的產(chǎn)物	1探針價(jià)格較高 2需要不同引物的擴(kuò)增效率一致，對(duì)引物的設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件要求比較高

 4 qPCR的實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)方法	原理	技術(shù)應(yīng)用	相關(guān)應(yīng)用
絕對(duì)定量(AbsoluteQuantification，AQ)	是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行分子數(shù)目的定量，即通常所說的拷貝數(shù)。	特定微生物的拷貝數(shù)檢測(cè) 特定功能基因的拷貝數(shù)檢測(cè) 特定抗性基因的拷貝數(shù)檢測(cè)	1臨床疾病診斷 2動(dòng)物疾病檢測(cè) 3食品安全 4科學(xué)研究 5應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
相對(duì)定量(RelativeQuantification，RQ)	測(cè)定目的基因在樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的絕對(duì)拷貝數(shù)，一般是通過CT值之差來計(jì)算。	樣本中某種特定微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種功能基因的微生物拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例 某種抗性基因拷貝數(shù)占全部微生物拷貝數(shù)的比例

 相對(duì)定量和絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)計(jì)算：

每微升拷貝數(shù)（copies/μl）=[質(zhì)粒濃度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量
原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μLDNA=拷貝數(shù)*稀釋倍數(shù)
原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/g樣本=（原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μLDNA*基因組DNA體積）/樣本抽提重量，（如果客戶樣本為DNA樣本，則不需要計(jì)算copies/g樣本）

相對(duì)定量的計(jì)算：

步驟1:內(nèi)參基因均一化樣本差異：Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因=△Ct

步驟2:其他樣本和對(duì)照樣本比較：△Ct處理樣本–△Ct對(duì)照樣本=△△Ct

步驟3:使用公式計(jì)算：倍數(shù)變化=2-△△Ct

 5 qPCR的實(shí)驗(yàn)流程

 6 qPCR檢測(cè)送樣要求

	樣本類型	樣品量/例	備注
環(huán)境	土壤/沉積物/淤泥	1g
	湖水/海水/河水	1L，用濾膜或離心富集	過 0.22μm 的濾膜，或者 12000rpm 離心，進(jìn)行富集。
	污水	20ml	若樣本清亮則可適當(dāng)?shù)囟嗳　?
	泥水混合樣	2ml
	空氣	根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用無菌濾膜過濾空氣。
	發(fā)酵物	固體 2g，液體 20ml

	樣本類型	樣品量/例	備注
人體	糞便	≥3g
	皮膚	5 個(gè)采集拭子	采集 5cm*5cm 面積，反復(fù)刮取 20 次。
	生殖道	5 個(gè)采集拭子	采集陰道口內(nèi) 4cm 處分泌物， 每個(gè)拭子轉(zhuǎn) 3 圈。
	牙菌斑/舌苔	5 個(gè)采集拭子	在采集的部位，刮取 10 次左右。
	唾液	10ml
	痰液	10ml 或 2-3 口痰液
	鼻腔	5 個(gè)采集拭子	采集鼻腔內(nèi)粘膜上的分泌物，轉(zhuǎn) 3 圈。
	肺部灌洗液	30ml 富集液	對(duì)灌洗液進(jìn)行離心富集。
	腸道/胃組織	5mm*5mm*3mm 3 塊	盡量多一取些。
	血液	3ml 全血	用 EDTA 抗凝管，顛倒 8-10 次。 不建議用肝素。
	尿液	30mL 尿液	取中段尿?yàn)橐恕?/span>
	母乳	5mL
動(dòng)物	糞便	≥3g	最少 0.05g。
	盲腸/結(jié)腸/胃 組織	≥3g	至少 1g，如果實(shí)驗(yàn)條件允許，盡可能多的收集樣本
	腸道內(nèi)容物	≥3g	最少 0.05g。建議客戶自己取內(nèi)容物，可以用 PBS 沖洗。

提醒

1 因?yàn)閝PCR絕對(duì)定量最終得到的是單位重量，或是單位體積目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，所以如果客戶送DNA，建議客戶記錄抽提DNA時(shí)樣本的使用重量或是體積，方便后繼對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

2 送樣時(shí)請(qǐng)盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保證運(yùn)輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3-4 公斤/天）。在打包時(shí)放入足量的干冰， 將樣本埋入干冰中， 為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用加厚的泡沫盒

 7 qPCR結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線

擴(kuò)增曲線

熔解曲線

定量結(jié)果

微基編號(hào)	拷貝數(shù)	樣本稀釋倍數(shù)	抽提樣本重量（g）	基因組DNA體積（μL）	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/μL DNA	原始樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)copies/g樣本	原始樣本目標(biāo)基因平均拷貝數(shù)copies/g樣本
1	1.08E+06	200	0.237	50	2.17E+08	2.26E+08	4.58E+10	4.76E+10
1	1.23E+06	200	0.237	50	2.47E+08		5.20E+10
1	1.07E+06	200	0.237	50	2.14E+08		4.51E+10
2	7.28E+05	200	0.24	50	1.46E+08	1.49E+08	3.03E+10	3.09E+10
2	7.55E+05	200	0.24	50	1.51E+08		3.15E+10
2	7.44E+05	200	0.24	50	1.49E+08		3.10E+10
3	1.24E+06	200	0.25	50	2.48E+08	2.59E+08	4.96E+10	5.19E+10
3	1.35E+06	200	0.25	50	2.69E+08		5.39E+10
3	1.30E+06	200	0.25	50	2.61E+08		5.21E+10
4	1.61E+06	200	0.234	50	3.21E+08	3.22E+08	6.87E+10	6.87E+10
4	1.60E+06	200	0.234	50	3.19E+08		6.82E+10
4	1.62E+06	200	0.234	50	3.24E+08		6.93E+10
5	1.27E+05	200	0.175	50	2.54E+07	2.66E+07	7.25E+09	7.59E+09
5	1.33E+05	200	0.175	50	2.66E+07		7.61E+09
5	1.39E+05	200	0.175	50	2.77E+07		7.91E+09

 8 術(shù)語解釋

Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光閾值（threshold）的設(shè)定：PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省（默認(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基線（baseline）：在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，即稱為基線。
熔解曲線Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需對(duì)qPCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈接擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，到達(dá)某一溫度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降，將此溫度稱為Tm值。不同PCR產(chǎn)物Tm值不同，從而可對(duì)PCR的特異性進(jìn)行鑒定。

 9 參考文獻(xiàn)

1 Dan Chen et.al. Microbial community and metabolism activity in a bioelectrochemical denitrification system under long-term presence of p-nitrophenol.2018.Bioresource Technology.（narG nirK nirS napA）

2 Lei Wang et.al. Responses of bacterial and archaeal communities to nitrate stimulation after oil pollution in mangrove sediment revealed by Illumina sequencing.2016.Marine Pollution Bulletin.（nirK nirS）

3 Hailu Wu et.al . Effects of root exudates on denitrifier gene abundance, community structure and activity in a micro-polluted constructed wetland. 2017.ScienceoftheTotalEnvironment. （nirK nirS）

4 Suresh Kumar Dubeyet.al. Methane production potential and methanogenic archaeal community structure in tropical irrigated Indian paddy soils. 2014.Biol Fertil Soils.（mcrA）

5 Juanli Yun et.al. Diversity, abundance and vertical distribution of methane-oxidizing bacteria (methanotrophs) in the sediments of the Xianghai wetland, Songnen Plain, northeast China .2011.JSoilsSediments.（pmoA）

6 Hongxia Du et.al.Mercury-methylatinggenes dsrB and hgcA insoils/sedim entsofthe Three Gorges Reservoir.2016.Environment Scientifi cPollution Research.（dsrB）

7 Si-Yu Zhang et.al. Si-Yu Zhang Diversity and Abundance of Arsenic Biotransformation Genes in Paddy Soils from Southern China.2015. Enveronmental Science Technology.（砷相關(guān)基因）

特定功能基因檢測(cè)，首發(fā)于微基生物。