細(xì)菌16S rRNA基因序列組成及引物選擇

微基生物進(jìn)行人體健康相關(guān)的研究與應(yīng)用：

• 數(shù)據(jù)庫：Silva，GreenGene，RDP

收集目前世界上最全面的三大微生物rRNA基因信息數(shù)據(jù)庫。

• 高通量測序

目前市面上常用的用于研究環(huán)境微生物的高通量測序平臺有Illumina，BGI，PacBio和Thermo Ion。針對于細(xì)菌的16S rRNA基因序列分析，Illumina 測序平臺憑借其測序讀長長、測序周期短、通量大等特點，成為使用最為普遍的測序平臺。 微基生物是國內(nèi)首家采用Illumina MiSeq 2×300 bp平臺進(jìn)行微生物生態(tài)研究，其最大讀長可達(dá)到550 bp，適合對V3、V4、V5區(qū)及V3-V4、V4-V5區(qū)進(jìn)行測序分析。

• 生信/統(tǒng)計分析

案例分析

標(biāo)題：由長期的土壤移植引起的緯度和氣候變化明顯改變了土壤微生物的變化率

研究領(lǐng)域：土壤微生物 分析物種：細(xì)菌 取樣方法：從中科院封丘站取1.4*1.2*1.0體積的土壤，分別向北移植到黑龍江海倫站，向南移植到江西鷹潭站。每組設(shè)3個重復(fù)，于2006-2011年每年的8-9月取20 cm的表層土，密封在聚乙烯包裝袋中，于-80?C保存。 高通量測序平臺：Illumina MiSeq 2×150 測序區(qū)域：16S rRNA gene V4區(qū) 樣本數(shù)及分組：分3組，3個重復(fù)，共63個樣本。 研究背景： 生物群體對由某些人為因素造成的潛在威脅（如氣候改變）的響應(yīng)是目前生態(tài)學(xué)研究的一個重要挑戰(zhàn)。鑒于微生物在生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用，它們對氣候改變的響應(yīng)有可能導(dǎo)致生態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。之前已有研究指出，溫度是影響土壤微生物組成和生態(tài)功能（土壤的呼吸作用、有機(jī)物的含量、固氮水平）的重要因素。而不同地域之間的土壤移植為研究微生物群落對氣候變化的響應(yīng)提供了新的研究方法和思路。 [/tabs] 主要結(jié)果： （1）微生物的演替 隨著時間的推移，向北、向南移植的土壤中，微生物的群落組成差異越來越大，微生物多樣性逐漸增加。

（2）由土壤移植引起的土壤微生物的變化

微生物隨時間衰減的斜率可以用來衡量微生物群落的相似性。本研究中，在各個樣本的微生物群落中都存在顯著的的時間衰減關(guān)系。向北、向南移植的土壤中，微生物隨時間衰減的斜率均比原位土壤的斜率大，尤其是在向南移植的土壤中。

隨著溫度的升高/降低，微生物的變化率也相應(yīng)地增加。隨著土壤向南移植，氣候變暖，微生物群落的波動性增大，微生物群落的變化增加。向南移植對土壤微生物群落的變化具有出更好的效果。有趣的是，研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落（門水平）的改變與分類學(xué)的分度有關(guān)。其中變形菌門、擬桿菌門和疣微菌門與門的豐度呈負(fù)相關(guān)，而酸桿菌門、放線菌門、后壁菌門和浮霉菌門與門的豐度呈正相關(guān)。

（3）細(xì)菌群落及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
　　在為期六年的試驗中，三個樣本共檢測出78個OTUs，其OTU的數(shù)量非常少，分屬于9個門。用MEGA 5作系統(tǒng)進(jìn)化樹，如下圖所示。

其中，酸桿菌門中的Gp4和Gp6、節(jié)細(xì)菌屬、硝化螺菌屬、鞘氨醇單胞菌、Fervidicoccus、Sphingosinicella、Steroidobacter和Terrimonas是主要菌群。

（4）微生物演替與環(huán)境因子的關(guān)系
　　微生物的演替與環(huán)境因子之間的關(guān)系用CCA分析如下。結(jié)果表明，向北移植的土壤中，微生物群落的多樣性與土壤的物理化學(xué)因子有關(guān)；而向南移植的土壤中，微生物群落的多樣性受溫度和降水的影響較大。 本研究采用illumina MiSeq測序平臺，對經(jīng)過移植的土壤微生物為研究對象，擴(kuò)增了細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)域，從而得到土壤中細(xì)菌種群分布的相關(guān)信息，對其中的微生物種群變化進(jìn)行了調(diào)查研究。
　　此實驗采用illumina MiSeq 2*150雙端測序，每個樣品可得到948,765條序列，其中有效序列為10,947條。研究發(fā)現(xiàn)，與原位土壤相比，向北移植（低溫）的土壤中，細(xì)菌的豐度增加，演替速率升高；向南移植（高溫）的土壤中，細(xì)菌的豐度降低，而演替速率達(dá)到最高，即穩(wěn)定性不好。推斷這是由于高溫環(huán)境容易引起高的代謝率和更加激烈的生存競爭造成的。 原文鏈接：http://www.nature.com/ismej/journal/vaop/ncurrent/full/ismej201578a.html 參考文獻(xiàn)： Liang, Y., Y. Jiang, F. Wang, C. Wen, Y. Deng, K. Xue, Y. Qin, Y. Yang, L. Wu, J. Zhou and B. Sun (2015). “Long-term soil transplant simulating climate change with latitude significantly alters microbial temporal turnover.” ISME J.

細(xì)菌或原核生物16S rRNA，首發(fā)于微基生物。

• 數(shù)據(jù)庫：Silva，RDP

微基生物擁有Silva、RDP數(shù)據(jù)庫，其中Silva數(shù)據(jù)庫是目前使用最廣泛的數(shù)據(jù)庫，目前涵蓋非重復(fù)18S rRNA基因序列及分類信息51553條。

• 高通量測序

微基生物是國內(nèi)首家采用Illumina-MiSeq 2×300 bp平臺進(jìn)行微生物生態(tài)研究，其讀長可達(dá)到550 bp，適合對真核生物18S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行測序分析。

• 生信 / 統(tǒng)計分析

  結(jié)果展示： 案例分析： 標(biāo)題：北冰洋中心區(qū)新開水域微微型浮游植物優(yōu)勢地位分析 分析物種：微微型浮游植物 高通量測序平臺：Roche 454 測序區(qū)域：18S V4區(qū) 主要實驗結(jié)果： 微微型浮游植物為該海域的優(yōu)勢群落，可占葉綠素生物量的44%-80%。青綠藻、硅藻、藍(lán)細(xì)菌、金藻及甲藻為鑒定出的主要光合浮游生物綱，分別占到微微型浮游植物的0–88%, 2–80%, 0–20%, 4–14% 及2–11%。其中真核生物的優(yōu)勢屬（種）為塔胞藻Pyramimonas (Pyramimonas gelidicola), 微胞藻Micromonas (Micromonas pusilla) 及棕囊藻Phaeocystis。值得注意的是，高通量測序分析的結(jié)果表明，塔胞藻要比泛北冰洋優(yōu)勢種微胞藻的相對豐度高3倍；而Pyramimonas gelidicola也為第一優(yōu)勢種，要比一直認(rèn)為的北冰洋夏季第一優(yōu)勢種Micromonas pusilla高1.5倍。典型相關(guān)性分析（CCA）結(jié)果表明：緯度和鹽度是影響微微型浮游植物群落組成及分布的主要因素。 圖1 微微型浮游植物的群落組成及環(huán)境因子分布的CCA展示圖 圖2 微微型浮游植物的群落組成（基于HPLC 色素分析及CHEMTAX方法）
原文鏈接：http://link.springer.com/article/10.1007/s00300-015-1662-7 參考文獻(xiàn)：
　　Zhang, F., J. He, L. Lin and H. Jin (2015). “Dominance of picophytoplankton in the newly open surface water of the central Arctic Ocean.” Polar Biology 38(7): 1081-1089.

真核生物 18S rRNA，首發(fā)于微基生物。