在自然界的各類(lèi)環(huán)境中，都有微生物的存在，它們?cè)诟髯缘摹皪徫弧鄙隙及l(fā)揮著或大或小、或多或少的作用。有一些具有特殊功能的微生物，由于其作用的重要性或特殊性而受到人們的廣泛關(guān)注，這些具有特殊功能的微生物叫做功能微生物，如氨氧化細(xì)菌、硫細(xì)菌、硝化細(xì)菌等。它們?cè)诜诸?lèi)學(xué)上有可能差異很大，但卻具有相同或類(lèi)似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的作用。支配這些功能細(xì)菌發(fā)揮重要功能的基因被稱(chēng)為功能基因，如amoA、dsrB、nxrA。目前微基生物已收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其對(duì)應(yīng)的種屬信息，構(gòu)建自己的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)。 微基生物進(jìn)行人體健康相關(guān)的研究與應(yīng)用：

功能基因/持家基因分析的流程圖如下：

• 數(shù)據(jù)庫(kù)：Silva，GreenGene，RDP

微基生物收集GeneBank中所有已知功能基因的序列及其對(duì)應(yīng)的種屬信息，構(gòu)建自己的功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

• 高通量測(cè)序

目前市面上常用的用于研究環(huán)境微生物的高通量測(cè)序平臺(tái)有Illumina，BGI，PacBio和Thermo Ion。其中Illumina平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)長(zhǎng)、測(cè)序周期短、通量大，成為常用的測(cè)序平臺(tái)。

微基生物是國(guó)內(nèi)首家采用Illumina MiSeq 2×300 bp平臺(tái)進(jìn)行微生物生態(tài)研究。在功能基因進(jìn)行測(cè)序分析方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

• 建庫(kù)及生信/統(tǒng)計(jì)分析

案例分析

標(biāo)題：Response of denitro bacteria involved in nitrogen removal for treatment of simulated livestock wastewater using a novel bioreactor脫氮細(xì)菌在新型生物反應(yīng)器處理模擬家畜廢水脫氮過(guò)程中的作用

Ecological Engineering（IF: 3.512）

研究領(lǐng)域：功能微生物

高通量測(cè)序平臺(tái)：Illumina MiSeq

測(cè)序區(qū)域：napA, narG, nirS, qnorB, and nosZ

主要結(jié)果：（1）微生物群落組成的演替反映在CFM組和DAS組之間的顯著差異的熱圖上， 主要體現(xiàn)為中華根瘤菌及固氮菌的不同比例。

（2）環(huán)境變量對(duì)反硝化群落的存在影響及優(yōu)勢(shì)屬與氮濃度有一定的相關(guān)性

（3）選出29個(gè)相對(duì)豐度較高的屬(每個(gè)功能基因選出3 ~ 4個(gè)相對(duì)豐度最高的屬)，構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)它們之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，選擇相對(duì)豐度和適應(yīng)性較高的菌株，如目標(biāo)生態(tài)位中的Burkholderia, Azoarcus, 和 Rhodanobacter ，加入到細(xì)菌接種劑可以實(shí)現(xiàn)快速繁殖，并通過(guò)自身的酶活性直接改變理化參數(shù)。此外，根據(jù)系統(tǒng)中的負(fù)相關(guān)關(guān)系，人工增菌可以抑制具有去除化學(xué)需氧量和氮的副作用的細(xì)菌，從而提高裝置的運(yùn)行效果。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0925857420300501

參考文獻(xiàn)：Wang L , Xu W , Yu J , et al. Response of denitrobacteria involved in nitrogen removal for treatment of simulated livestock wastewater using a novel bioreactor[J]. Ecological Engineering, 2020, 147:105762.

特定功能微生物多樣性分析，首發(fā)于微基生物。

采用16S rDNA /18S rDNA/ ITS通用基因進(jìn)行微生物多樣性分析，所研究的是樣本中的全部微生物，并不能夠?qū)μ囟üδ艿哪承┓N屬內(nèi)微生物進(jìn)行詳盡的分類(lèi)研究。通過(guò)對(duì)某些特定功能的靶基因高通量測(cè)序分析，能夠?qū)λ承┓N屬內(nèi)的目的微生物進(jìn)行詳細(xì)的分類(lèi)研究，更加清晰的分析目的微生物的物種信息及生態(tài)分布情況。
傳統(tǒng)的靶基因建庫(kù)方法，直接采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建靶基因文庫(kù)，再進(jìn)行Sanger測(cè)序，整個(gè)研究過(guò)程耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間及人力，測(cè)序費(fèi)用昂貴；利用高通量測(cè)序?qū)Π谢蚪◣?kù)分析，數(shù)據(jù)量大幅度提高，費(fèi)用卻大幅下降，且能對(duì)樣本中靶基因的分布進(jìn)行定量分析。

客戶(hù)可根據(jù)自己的需求，提供所需研究的靶基因的特異引物，我們來(lái)負(fù)責(zé)構(gòu)建適合illumina miseq平臺(tái)或是Roche 454平臺(tái)測(cè)序所需的文庫(kù)。在數(shù)據(jù)分析時(shí)，通常情況下，參照數(shù)據(jù)庫(kù)（reference database）都是通用庫(kù)，比如silva的16S/18S數(shù)據(jù)庫(kù)。但是對(duì)于靶基因，在沒(méi)有通用庫(kù)的情況下，一般上千條序列即可構(gòu)建靶基因的參照數(shù)據(jù)庫(kù)，我們可根據(jù)客戶(hù)提供的序列信息進(jìn)行自建庫(kù)的構(gòu)建，為序列的后續(xù)數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析提供資料。

技術(shù)路線：

1、定鞭金藻：

定鞭藻門(mén)是海洋原生生物的一個(gè)關(guān)鍵門(mén)。近年來(lái)，更多研究者著力于定邊藻門(mén)微生物的研究，他們利用核糖體DNA大亞基（LSU rDNA）的一對(duì)特異引物，基于Roche 454測(cè)序平臺(tái)對(duì)靶基因進(jìn)行建庫(kù)分析。

研究案例：

Lucie Bittner等基于核糖體DNA大亞基（LSU DNA）D1和D2區(qū)域的定鞭金藻特異引物和Roche 454測(cè)序平臺(tái)對(duì)Naples Bay中未培養(yǎng)的定鞭金藻多樣性分布模式進(jìn)行分析。本文通過(guò)自己構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)（包括1290個(gè)環(huán)境定鞭金藻的環(huán)境克隆文庫(kù)和172個(gè)培養(yǎng)定鞭金藻菌株的序列），將測(cè)序結(jié)果與之進(jìn)行比對(duì)分析。該文章也闡述了在研究大量未知單細(xì)胞真核微生物多樣性中在技術(shù)和理論上的固有障礙。

參考文獻(xiàn)：
Diversity patterns of uncultured Haptophytes unraveled by pyrosequencing in Naples Bay

所得主要結(jié)果：
（A）將13501個(gè)reads與172個(gè)培養(yǎng)定鞭金藻序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖譜，節(jié)點(diǎn)或是分支處的綠色圓點(diǎn)代表reads的數(shù)目。該樹(shù)形圖譜形象的展示所得結(jié)果中可以分析出定鞭金藻的種類(lèi)。
（B）定鞭金藻分類(lèi)后，每個(gè)樣本中各物種所占的百分比。清楚的了解到Naples Bay定鞭金藻的物種分布情況。

2、硝化菌：

硝化細(xì)菌在促進(jìn)水域生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)、保持健康水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境方面發(fā)揮著巨大作用。硝化作用(Nit rification) 是將氨氧化成亞硝酸(鹽) ，再氧化成硝酸(鹽) 的過(guò)程。前者主要是由自養(yǎng)性的亞硝酸菌或氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria，AOB) 完成，后者是由硝酸菌或亞硝酸鹽氧化菌(Nit rite oxidizing bacteria，NOB) 完成。氨氧化菌還包括氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea，AOA）

除了16S rRNA 基因以外，催化氨氧化的功能基因氨單加氧酶α亞基基因( amoA ) 也被廣泛用做自然環(huán)境中AOB、AOA 遺傳多樣性及豐度研究的分子標(biāo)記。氮氧化中的關(guān)鍵酶（catalytic subunit of nitrite oxidoreductase ，NXR)的編碼基因nxrA被用作研究NOB多樣性。

研究案例：

Hang-Wei Hu等利用454測(cè)序技術(shù)，通過(guò)古菌的16S rRNA gene和 AOA 、AOB的功能基因amoA研究來(lái)自不同區(qū)域的65份土壤樣本中氨氧化微生物的相對(duì)豐度、多樣性及群落組成情況，研究結(jié)果表明，氨氧化微生物的分布與土壤的pH值有密切相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)：
pH-dependent distribution of soil ammonia oxidizers across a large geographical scale as revealed by high-throughput pyrosequencing

所得主要結(jié)果：
對(duì)不同pH值條件下氨氧化微生物中各物種分布相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖，氨氧化微生物的群落組成與土壤的pH值有密切的關(guān)系。

3、反硝化菌

隨著現(xiàn)代研究的不斷發(fā)展，更多的反硝化微生物從土壤、沉積物、水環(huán)境中分離得到。由于反硝化微生物是一大類(lèi)生物類(lèi)群，現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于細(xì)菌、真菌及古菌中，因此傳統(tǒng)經(jīng)典的16S rDNA方法就不適合反硝化菌的生態(tài)學(xué)研究。因此，一些功能基因，如反硝化酶編碼基因常被選作分子探針和引物設(shè)計(jì)的模板用于多種生態(tài)環(huán)境下微生物體系與種群結(jié)構(gòu)的分析。如：硝酸鹽還原酶編碼基因Nar、亞硝酸鹽還原酶編碼基因Nir、氧化還原酶編碼基因Nor、氧化亞氮還原酶編碼基因Nos。

研究案例：

法國(guó)研究者Philippot 等利用高通量測(cè)序技術(shù)分析反硝化微生物，采用了 454 測(cè)序平臺(tái)對(duì)反硝化菌的nosZ 基因進(jìn)行了測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了微生物多樣性的降低會(huì)顯著影響反硝化微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)：
Loss in microbial diversity affects nitrogen cycling in soil. ISME J. 2013

所得主要結(jié)果
（1）將樣本稀釋處理，D1為原濃度、D2為稀釋10³倍、D3為稀釋10⁵倍，進(jìn)行Faith’s PD稀釋曲線繪制，發(fā)現(xiàn)反硝化微生物的物種多樣性隨稀釋倍數(shù)升高而降低。

（2）通過(guò)unweighted UniFrac distances進(jìn)行PCoA分析，發(fā)現(xiàn)不同稀釋條件下，微生物群落分布存在顯著地不同。

研究案例

芬蘭學(xué)者Palmer K利用了 454 高通量測(cè)序技術(shù)，研究了受凍裂影響的北極苔原泥炭土反硝化微生物特征與 N2O 排放的相互關(guān)系，對(duì) 功能基因narG、nirK/nirS 以及 nosZ 進(jìn)行了測(cè)序分析和定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高 N2O 排放量都和土壤中的一些特殊反硝化微生物有關(guān)，說(shuō)明N2O 排放量的大小和土壤中反硝化組成是有對(duì)應(yīng)關(guān)系的。

參考文獻(xiàn)：
Contrasting denitrifier communities relate to contrasting N2O emission patterns from acidic peat soils in arctic tundra. The ISME Journal. 2012

4 硫酸鹽還原菌

硫酸鹽還原菌 (Sulfate-Reducing Bacteria，簡(jiǎn)稱(chēng)SRB) 是一種厭氧的微生物。廣泛存在于土壤、海水、河水、地下管道以及油氣井等缺氧環(huán)境中。研究表明在無(wú)氧或極少氧情況下，它能利用金屬表面的有機(jī)物作為碳源，并利用細(xì)菌生物膜內(nèi)產(chǎn)生的氫，將硫酸鹽還原成硫化氫，從氧化還原反應(yīng)中獲得生存的能量。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，SRB目前已有12個(gè)屬40多個(gè)種 ，SRB的分類(lèi)學(xué)研究進(jìn)展比較緩慢。生理學(xué)上分為兩類(lèi)：將硫酸鹽還原為硫化氫，將硫酸鹽還原為硫。

SRB 硫酸鹽還原途徑中的腺苷酰硫酸還原酶( adenosine-5′-phosphosulfate reductase，Apr) 基因和異化型亞硫酸鹽還原酶( dissimilatory sulfite reductase，Dsr) 基因是它常用的遺傳標(biāo)記物。

研究案例

wenjing jia等采用半巢式PCR技術(shù)，基于Roche 454平臺(tái)對(duì)CD、IBS、UC患者與健康人糞便中硫酸鹽還原菌的多樣性及分布進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)主要的物B. wadsworthia和Desulfovibrio piger在健康人群占全部SRB的93.5%，但是在所有患者中的比例都是相對(duì)較低的。

參考文獻(xiàn)：
Diversity and distribution of sulphate-reducing bacteria in human faeces from healthy subjects and patients with inflammatory bowel disease

所得主要結(jié)果
（1）在7個(gè)分組中，4中SRB所占的百分比的統(tǒng)計(jì)圖如下，SRB中兩個(gè)主要物種在健康人中所占比例較6個(gè)患者組相對(duì)較高。

（2）本研究發(fā)現(xiàn)一致序列共包括9個(gè)種系型，與8 個(gè)參照物種一同構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。形象顯示分析結(jié)果與參照物種之前的關(guān)系。 Bilophila wadsworthia, Desulfovibrio piger, D. desulfuricans F28-1 and Desulfovibrio NY682它們與參照物種的標(biāo)簽在圖上重合，以至于很難區(qū)分它們。

靶基因建庫(kù)分析，首發(fā)于微基生物。