16S rRNA基因高通量測序的關(guān)鍵點(diǎn)-測序區(qū)域的選擇

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16s rRNA基因高通量測序的關(guān)鍵點(diǎn)-測序區(qū)域的選擇，首發(fā)于微基生物。

基于16S rRNA基因的高通量測序分析

案例介紹

文章簡介：國家海洋局第一海洋研究所利用高通量測序平臺對南極菲爾德斯半島土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。該研究成果發(fā)表于《Frontiers in microbiology》（影響因子3.989）

英文題目：Diversityand structure of soil bacterial communities in the Fildes Region（maritime Antarctica）as revealed by 454 pyrosequencing

中文題目：南極菲爾德斯半島土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的研究

測序平臺：Roche454

測序區(qū)域：16SV1-V3

分析樣本：土壤樣本

　　要點(diǎn)簡析：采用高通量測序技術(shù)對南極地區(qū)菲爾德斯半島的人類聚居地、企鵝聚居地、海象聚居地和原始區(qū)域土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。研究表明四種類型土樣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，通過冗余分析發(fā)現(xiàn)，pH、磷、有機(jī)碳、有機(jī)氮是影響土壤細(xì)菌群落分布的最主要因素。

　　研究背景：南極氣候非常惡劣，其簡單的生態(tài)系統(tǒng)極易受到氣候變化、人類活動(dòng)等干擾因子的影響。近年來隨著氣候的變暖，無冰的區(qū)域?qū)U(kuò)大，企鵝、海象將逐漸增多，人類活動(dòng)將更加頻繁，陸地微生物可能會(huì)發(fā)生變化，因此很有必要了解南極地區(qū)無冰區(qū)土壤微生物和人類、動(dòng)物之間的關(guān)系。

　　菲爾德斯半島是南極地區(qū)最大的無冰區(qū)，人類活動(dòng)頻繁，企鵝和海象也比較常見。因此選擇在該地區(qū)采用454高通量測序技術(shù)，對人類聚居地、企鵝聚居地、海象聚居地和原始區(qū)域土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。

主要結(jié)果：

　　在4種類型土樣中，土壤細(xì)菌多樣性最大的是企鵝聚居地土壤，其次是原始土壤、人類聚居地土壤和海象聚居地土壤。4種類型的土樣中都含有豐富的變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門。4種類型土樣的化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)存在顯著差異。4種類型土壤中，熱袍菌門、藍(lán)藻、纖維桿菌門、耐輻射嗜、綠菌門在豐度上存在顯著差異。通過基于距離的冗余分析發(fā)現(xiàn)，pH、磷、有機(jī)碳、有機(jī)氮是影響土壤細(xì)菌群落分布的最主要因素。

樣品的Venn圖

50個(gè)OTUs的網(wǎng)絡(luò)圖

基于16S rRNA基因的微生物多樣性分析—高通量測序，首發(fā)于微基生物。

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　　對于微生物群落多樣性分析，基于Roche 454 FLX +、Illumina MiSeq、Ion Torrent PGM等高通量測序平臺，對核糖體DNA高變區(qū)域，比如16S/18S/ITS等序列或功能基因，比如細(xì)菌和古菌的氨氧化酶基因、硫酸鹽還原菌的異化型亞硫酸鹽還原酶基因進(jìn)行測序分析，揭示環(huán)境樣品中眾多不同類型微生物種類以及它們之間的相對豐度和進(jìn)化關(guān)系。

　　MiSeq測序系統(tǒng)采用Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測序技術(shù)，集擴(kuò)增、測序和數(shù)據(jù)分析的測序儀，每次運(yùn)行能產(chǎn)生超過7 Gb的數(shù)據(jù)，循環(huán)時(shí)間短、測序準(zhǔn)確，通過專利的可逆終止試劑方法對數(shù)百萬片段進(jìn)行平行測序。當(dāng)dNTP加入時(shí)，對熒光標(biāo)記的終止子成像、切割、到下一個(gè)堿基的摻入。由于每個(gè)測序循環(huán)中四種可逆終止子結(jié)合的dNTP都存在，所以自然競爭讓摻入偏差最小化。根據(jù)每個(gè)循環(huán)的熒光信號測定直接檢出堿基，與其他技術(shù)相比大大降低了原始錯(cuò)誤率和可靠的堿基檢出。

MiSeq新型測序流程：
　　制備文庫的DNA起始量可低至50 ng
　　簇生成和測序都在MiSeq上完成
　　最后在內(nèi)置的儀器計(jì)算機(jī)上開展數(shù)據(jù)分析
平臺優(yōu)勢：
　　價(jià)格低
　　Miseq測序長度長約500bp
　　高通量測序產(chǎn)出高
　　全自動(dòng)的工作流程
　　最精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量
應(yīng)用領(lǐng)域：
　　靶向重測序 (Targeted Resequencing)
　　PCR擴(kuò)增：基于Nextera的快速文庫制備（1.5小時(shí)）和36 bp測序
　　高度多重的擴(kuò)增子測序 (Amplicon Sequencing)
　　雜交捕獲 (Hybrid Capture)
　　16S宏基因組 (16S Metagenomics)
　　克隆檢驗(yàn) (Clone Checking)
　　小基因組測序 (Small Genome Sequencing)
　　de novo測序
　　重測序
　　質(zhì)粒測序
　　RNA測序 (RNA Sequencing)
　　小RNA測序
　　RNA-seq
　　文庫質(zhì)控
　　調(diào)控
　　ChIP-seq

Roche 454
工作原理：?
　　454高通量測序是一種依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析的新技術(shù)，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測DNA序列的目的。
工作流程：?
　　1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將基因組DNA/cDNA片段化處理至300-800bp間，經(jīng)末端修復(fù)與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA；
　　2、Emulsion PCR：單鏈DNA文庫被固定在DNA捕獲磁珠上，每個(gè)磁珠結(jié)合了一個(gè)獨(dú)立的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個(gè)獨(dú)特的片斷在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫的擴(kuò)增平行進(jìn)行。擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序?qū)嶒?yàn)；
　　3、測序反應(yīng)：攜帶DNA片段的磁珠被放入PTP板中供測序反應(yīng)使用。PTP孔的直徑（29um）確保每個(gè)孔只能容納一個(gè)珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，每個(gè)核苷酸依次流入開放的孔洞和DNA捕獲磁珠建。每一個(gè)與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸的添加都會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的信號，并被測序儀CCD照相機(jī)所捕獲；
　　4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時(shí)的運(yùn)行當(dāng)中可獲得100余萬個(gè)讀長，讀取超過4-6億個(gè)堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學(xué)工具對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并應(yīng)用于不同領(lǐng)域。
技術(shù)特點(diǎn)：?

• 速度快
• 測序讀長最長,平均400-500個(gè)堿基；
• 準(zhǔn)確度高
• 一致性好
• 可以進(jìn)行Pair－End測序研究；

應(yīng)用范圍：
　　1、全基因組測序
　　2、比較基因組研究
　　3、轉(zhuǎn)錄組和基因調(diào)節(jié)研究
　　4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析

Ion Torrent PGM
應(yīng)用領(lǐng)域：微生物基因組測序和重測序，靶基因目標(biāo)（擴(kuò)增子）區(qū)域重測序
擴(kuò)展性：半導(dǎo)體芯片技術(shù)
簡捷：自然的生物化學(xué)原理
快速：2個(gè)小時(shí)完成測序
　　Ion Torrent Personal Genome Machine(個(gè)人操作基因組測序儀以下簡稱：PGM?)，相較其他測序技術(shù)，更簡單、經(jīng)濟(jì)和擴(kuò)展性更好的測序平臺。PGM?臺式系統(tǒng)配合革新性的半導(dǎo)體芯片技術(shù)，使整個(gè)平臺具有極高的擴(kuò)展性和快速完成測序的性能。
Ion Torrent技術(shù)通過專有的大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器，對DNA 復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的離子流，實(shí)現(xiàn)直接和實(shí)時(shí)的檢測。當(dāng)試劑通過集成的流體通路進(jìn)入 Ion Torrent 半導(dǎo)體芯片中，密布于芯片上的反應(yīng)孔立即成為上百萬個(gè)微反應(yīng)體系。這種獨(dú)特的流體體系，微體系機(jī)械設(shè)計(jì)和半導(dǎo)體的技術(shù)組合，使我們得以快速直接的將遺傳信息翻譯成數(shù)碼的 DNA 測序結(jié)果，得到大量高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。
　　PGM?服務(wù)整合Ion Torrent 的半導(dǎo)體芯片、反應(yīng)試劑盒、計(jì)算機(jī)服務(wù)器和數(shù)據(jù)分析套件為您提供最全面最優(yōu)質(zhì)的測序服務(wù)。
PGM?更高通量，更大價(jià)值，其測序通量完全超過其他測序通量高出至少一個(gè)數(shù)量級。

高通量測序平臺，首發(fā)于微基生物。

• 數(shù)據(jù)庫：Silva，RDP

微基生物擁有Silva、RDP數(shù)據(jù)庫，其中Silva數(shù)據(jù)庫是目前使用最廣泛的數(shù)據(jù)庫，目前涵蓋非重復(fù)18S rRNA基因序列及分類信息51553條。

• 高通量測序

微基生物是國內(nèi)首家采用Illumina-MiSeq 2×300 bp平臺進(jìn)行微生物生態(tài)研究，其讀長可達(dá)到550 bp，適合對真核生物18S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行測序分析。

• 生信 / 統(tǒng)計(jì)分析

  結(jié)果展示： 案例分析： 標(biāo)題：北冰洋中心區(qū)新開水域微微型浮游植物優(yōu)勢地位分析 分析物種：微微型浮游植物 高通量測序平臺：Roche 454 測序區(qū)域：18S V4區(qū) 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 微微型浮游植物為該海域的優(yōu)勢群落，可占葉綠素生物量的44%-80%。青綠藻、硅藻、藍(lán)細(xì)菌、金藻及甲藻為鑒定出的主要光合浮游生物綱，分別占到微微型浮游植物的0–88%, 2–80%, 0–20%, 4–14% 及2–11%。其中真核生物的優(yōu)勢屬（種）為塔胞藻Pyramimonas (Pyramimonas gelidicola), 微胞藻Micromonas (Micromonas pusilla) 及棕囊藻Phaeocystis。值得注意的是，高通量測序分析的結(jié)果表明，塔胞藻要比泛北冰洋優(yōu)勢種微胞藻的相對豐度高3倍；而Pyramimonas gelidicola也為第一優(yōu)勢種，要比一直認(rèn)為的北冰洋夏季第一優(yōu)勢種Micromonas pusilla高1.5倍。典型相關(guān)性分析（CCA）結(jié)果表明：緯度和鹽度是影響微微型浮游植物群落組成及分布的主要因素。 圖1 微微型浮游植物的群落組成及環(huán)境因子分布的CCA展示圖 圖2 微微型浮游植物的群落組成（基于HPLC 色素分析及CHEMTAX方法）
原文鏈接：http://link.springer.com/article/10.1007/s00300-015-1662-7 參考文獻(xiàn)：
　　Zhang, F., J. He, L. Lin and H. Jin (2015). “Dominance of picophytoplankton in the newly open surface water of the central Arctic Ocean.” Polar Biology 38(7): 1081-1089.

真核生物 18S rRNA，首發(fā)于微基生物。