低偏差擴(kuò)增建庫(kù)

采用二代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）進(jìn)行微生物多樣性研究，文庫(kù)制備至關(guān)重要。在高通量測(cè)序過(guò)程中，文庫(kù)構(gòu)建需要PCR擴(kuò)增對(duì)原始樣本序列進(jìn)行指數(shù)放大，而在此過(guò)程中產(chǎn)生的差異也是必不可免的，他決定了樣本中微量或是痕量微生物是否被檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果是否能真實(shí)地反應(yīng)樣本中微生物的存在情況。較傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增不同，微基生物采用頂級(jí)期刊science發(fā)表的文章中低偏差擴(kuò)增測(cè)序（Low Error Amplicon Sequencing，LEA-Seq）方法，這種建庫(kù)方法更真實(shí)的反應(yīng)環(huán)境中微生物的存在。

LEA-Seq擴(kuò)增原理：特異引物融合測(cè)序引物和二代測(cè)序儀器所必須的adaptor后是一條長(zhǎng)度將近100bp的引物，引物過(guò)長(zhǎng)PCR擴(kuò)增效果會(huì)相對(duì)降低。所以LEA-Seq方法是將引物設(shè)計(jì)成兩條相對(duì)較短的引物，分別包括正向內(nèi)側(cè)引物，正向外側(cè)引物，反向內(nèi)側(cè)引物，反向外側(cè)引物。首先利用低濃度的正向內(nèi)側(cè)引物，對(duì)目的片段進(jìn)行少數(shù)循環(huán)的線性擴(kuò)增，隨后加入正向外側(cè)引物、反向內(nèi)側(cè)引物及反向外側(cè)引物進(jìn)行目的片的指數(shù)擴(kuò)增，詳細(xì)描述可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：The Long-Term Stability of the Human Gut Microbiota. Science