一  背景

腫瘤微生物組學（Tumor Microbiome Studies）是研究腫瘤微環(huán)境中微生物群落的科學，它聚焦于研究存在于腫瘤組織微環(huán)境中的微生物群落，包括細菌、真菌、病毒以及可能的其他微生物實體。這些微生物與宿主細胞之間的相互作用可能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移乃至對治療的響應產(chǎn)生重要影響。

腫瘤微生物組學作為腫瘤研究的新領域，為我們理解腫瘤的復雜性提供了新的視角，并有潛力為癌癥的預防、診斷和治療帶來革新性的變化。隨著研究的深入，我們期待這一領域能夠揭示更多關于腫瘤與微生物之間相互作用的奧秘，并為癌癥治療提供新的策略。

 

細菌與腫瘤的關系示意圖

 

二  腫瘤微生物檢測方法

2.1  16S擴增子測序

通過16S rRNA基因的特定區(qū)域（如V3-V4區(qū)）進行PCR擴增，然后進行高通量測序，以鑒定樣本中的微生物種類。能夠揭示腫瘤組織中微生物的多樣性、相對豐度和系統(tǒng)發(fā)育關系。

16S擴增子測序是鑒定細菌和古菌群落結構的常用方法，但通常分辨率限于屬水平，且難以區(qū)分新物種。 

 

 

2.2  腫瘤微生物qPCR定量檢測

實時熒光定量PCR（qPCR）技術是一種高度靈敏和特異的分子生物學檢測手段，它通過實時監(jiān)測PCR擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號來定量分析DNA或RNA分子。     

在腫瘤微生物qPCR檢測中，該技術被用來定量分析腫瘤組織或相關樣本中的微生物核酸，從而揭示微生物群落的組成和豐度，這對于理解腫瘤微環(huán)境中微生物的作用及其與腫瘤發(fā)展的關系具有重要意義。

qPCR檢測方法的優(yōu)勢：

? 高靈敏度和特異性：qPCR技術利用特異性引物和熒光標記的探針，能夠檢測到極少量的核酸模板，從而實現(xiàn)對微生物含量的精確測定。

? 快速性：qPCR實驗通常在幾小時內完成，從核酸提取到結果分析，大大縮短了檢測時間。

? 可重復性和標準化：實驗操作流程標準化，結果易于復制，便于不同實驗室之間的結果比較。

? 定量能力：qPCR能夠提供定量結果，不僅可以檢測微生物是否存在，還可以測定其相對或絕對數(shù)量。

? 多樣本并行檢測：96孔或384孔的qPCR板可以同時檢測多個樣本，提高實驗效率。

微基生物可以根據(jù)客戶的目標和要求，設計針對目標菌株的特異性引物和探針，有效促進目標菌株的檢測、篩選和鑒定。

 

2.3  腫瘤微生物ddPCR定量檢測

腫瘤微生物的微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）定量檢測是一種高靈敏度和高準確度的核酸分子檢測技術，它可以對腫瘤組織或體液中的微生物DNA進行絕對定量分析。而且較好的克服了腫瘤組織包埋標本DNA質量差、標本量有限等問題，目前已經(jīng)被應用于多個研究領域，有望成為惡性腫瘤的診斷和監(jiān)測的可靠工具。

ddPCR檢測方法的優(yōu)勢：

? 高靈敏度和準確性：ddPCR能夠檢測到低至0.001%豐度的突變靶標，適合痕量微生物DNA的檢測。

? 絕對定量：ddPCR不需要標準曲線，可以直接計算出目標DNA的拷貝數(shù)。

? 抗抑制劑能力：對PCR反應中的抑制劑具有較高的耐受性，適合直接從臨床樣本中進行檢測。

? 無需依賴Ct值：與qPCR不同，ddPCR不依賴于Ct值，因此不受擴增效率的影響。

? 適合多重檢測：可以同時檢測多個靶標，提高實驗效率。

微基生物提供ddPCR引物、探針設計、優(yōu)化及檢測服務，對微生物特異性種屬精確定量。

 

2.4  種或屬分類級別特異性的細菌16S FISH雜交檢測

腫瘤微生物種或屬分類級別特異性的細菌16S 熒光原位（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）雜交檢測是一種利用熒光標記的核酸探針針對腫瘤組織中微生物的16S rRNA基因序列進行特異性結合的分子生物學技術。這種技術可以對腫瘤組織中的微生物進行定性、定位和半定量分析，提供關于微生物種類、空間分布以及與宿主相互作用的詳細信息。

16S FISH雜交檢測的優(yōu)勢：

? 細胞定位能力：能夠直接在組織切片中觀察微生物的分布情況。

? 高特異性：利用特異性探針可以區(qū)分不同的微生物種類或屬。

? 直觀性：熒光顯微鏡下的直觀圖像便于分析和解釋結果。

? 多標定量：可以同時使用多個探針，對多種微生物進行同時檢測。

實驗過程:

探針變性、標本變性、雜交、洗脫、雜交信號放大(生物素標記的探針)、復染、封片、熒光顯微鏡觀察FISH結果。

EUB338探針檢測小鼠腸道中的所有細菌

微基生物提供微生物種屬特異性16S FISH探針設計及檢測服務，對種屬特異性16S FISH探針系統(tǒng)性評測，確保其高特異性及通用性。

 

2.5  腫瘤組織中微生物的分離培養(yǎng)

培養(yǎng)組學（Culturomics）是一種綜合方法，使用多種培養(yǎng)條件在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)細菌菌落，然后使用16S rDNA測序或MALDI-TOF質譜平臺對其進行鑒定，是了解特定菌或菌群在宿主中作用的關鍵?？梢暂^大程度的發(fā)現(xiàn)潛在的新菌株和微生物，豐富現(xiàn)有的可培養(yǎng)微生物資源庫。

利用培養(yǎng)組學（多達48或96種條件）將原始樣本中可培養(yǎng)微生物大大富集并進行微生物組學的檢測，使原始樣本中可檢測的微生物類型大為豐富。為此后的微生物的培養(yǎng)分離驗證了條件。

使用需氧/厭氧活菌保存液保存樣本，微生物的種類更豐富，多樣性更顯著。

培養(yǎng)方法的優(yōu)勢

? 直接性：直接從腫瘤組織中分離微生物，避免了因樣本處理導致微生物DNA污染的問題。

? 可重復性：培養(yǎng)條件標準化，實驗結果可重復性強。

? 多樣性分析：可以分析腫瘤組織中微生物的多樣性和豐度。

? 功能研究：分離的微生物可以用于后續(xù)的功能研究，如藥物敏感性測試和致病機制研究。

微基生物分離培養(yǎng)檢測示意圖

 

  

這些技術方法各有優(yōu)勢和局限性，通常結合使用以獲得更全面的腫瘤微生物組信息。例如，16S擴增子測序可以提供微生物多樣性的概覽，而qPCR或ddPCR可以提供特定微生物的定量信息。FISH技術有助于理解微生物的空間分布，而培養(yǎng)分離則可以深入研究微生物的生物學特性。通過這些方法的綜合應用，研究人員能夠更好地理解腫瘤微生物組的組成、功能以及它們與腫瘤發(fā)展和治療之間的相互作用。

 

三   樣本類型

在多種實體腫瘤中檢測到微生物群，包括肝臟、膀胱、腎臟、前列腺、胰腺、腦、食管癌、結腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌和婦科癌。腫瘤內微生物群已被證實與腫瘤發(fā)生、腫瘤進展和耐藥有關。

 

不同癌癥類型的腫瘤內微生物群生態(tài)位

目前腫瘤微生物檢測常用樣本主要包括福爾馬林固定石蠟包埋組織(formalin－fixed paraffin－embedding, FFPE)樣本(包括手術切除和活檢組織樣本)和體液樣本(包括外周血、腦脊液、漿膜腔積液上清液、唾液和尿液等)，應依據(jù)臨床需求、樣本可及性及不同的檢測平臺性能選擇合適的樣本。

3.1  不同類型樣本檢測方法的選擇

每種樣本類型都有其特定的優(yōu)勢和局限性，選擇合適的樣本類型和檢測方法對于準確評估腫瘤微生物組至關重要。具體樣本詳情請進一步咨詢：021-50763698。

 

 

四   不同類型樣本保存套裝

實體腫瘤微生物樣本種類繁多，可根據(jù)具體腫瘤樣本的類型及選擇的腫瘤微生物的檢測平臺選擇合適的取樣方式、取樣量、保存方式等。

微基生物可提供：不同類型樣本保存套裝

 

五  腫瘤微生物檢測相關文獻

5.1 肝細胞癌的腫瘤微生物組特征： 16s+FISH+分離培養(yǎng)+qPCR

我們使用16S rRNA基因測序156個肝臟樣本，分析了人類正常肝臟、腫瘤周圍和肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）組織的微生物譜，并確定了可能用于HCC診斷的特定微生物特征。我們還利用熒光原位雜交(FISH)和新鮮組織培養(yǎng)方法驗證了HCC中腫瘤內微生物的存在。

5.1.1采用的檢測方法

? 細菌16S rRNA基因全面DNA測序，發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍和HCC微生物群的α和β多樣性均有所增加。

? 熒光原位雜交（FISH）顯示，微生物DNA分布在肝細胞和紅細胞的細胞質中。

? 通過新鮮組織培養(yǎng)在HCC組織中恢復了有活力的厭氧或好氧細菌。

? 采用獨立隊列(qPCR_cohort)對12份組織樣本進行定量PCR驗證。

5.1.2部分樣本情況

FISH檢測樣本類型：手術過程中收集新鮮組織，制備石蠟切片，蘇木精-伊紅(H&E)染色，小心避免污染。新鮮組織被儲存在無菌管中，在與患者身體分離后立即在冰上冷卻。所有后續(xù)步驟均在冰上進行。

分離培養(yǎng)樣本類型：將新鮮的腫瘤組織和腫瘤周圍組織浸泡在無菌培養(yǎng)皿中的生理鹽水中。

5.1.3結果展示

正常肝臟、腫瘤周圍和HCC樣本的16S rRNA基因測序。

168個正常、腫瘤組織和HCC組織的16S rDNA測序

作者通過16S rDNA測序分析肝癌組織微生物群的結構和豐度，檢測了68對HCC和癌旁組織配對樣本、29例正常肝組織和3例獨立的肝癌組織。與正常肝組織相比，HCC中微生物群的α多樣性顯著增加，癌旁組織富集有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteriota），而正常組織中副桿菌（Patescibacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota）豐度更高（圖4A-D）；而HCC組織中顯示出更高的Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteriota，而Patescibacteria和Acidobacteriota的豐度較低（圖4E-F）。以上結果表明，與對照組相比HCC組織和癌旁組織具有相似的微生物特征，但是分析其他菌群發(fā)現(xiàn)變形菌（Gammaproteobacteria）在HCC組織顯著富集而不在癌旁組織中顯著富集。為了驗證這一結果，作者通過qPCR對Gammaproteobacteria進行分析發(fā)現(xiàn)與測序結果一致，癌組織中的Gammaproteobacteria豐度顯著高于正常組織（圖4I-J）。LEfSe結果證實，與健康對照相比HCC組織Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteriota增加，而Acidobacteriota、分歧桿菌（Parcubacteria）、酸桿菌（Acidobacteriae）減少（圖5C-D）；

正常、腫瘤周圍和 HCC 組織中的腫瘤內微生物概況。（截取部分）

A.餅圖顯示了基于OTU的所有肝臟微生物群中每個門的比例。B.在NM，Pt和HccM的門和類水平的分類組成的條形圖。

C和D.在門或類別水平上的豐度在正常微生物群和腫瘤周圍微生物群之間有顯著差異。

LEfSe分析揭示組織樣本中的特定類群

 

A.支序圖顯示正常(N)組織和腫瘤周圍(P)組織之間具有顯著差異豐度的分類樹。B.顯示正常人和腫瘤周圍受試者之間細菌分類群的線性判別分析的直方圖。C.支序圖顯示正常(N)組織和HCC(T)組織之間分類樹具有顯著差異的豐度。D.顯示正常(N)和HCC受試者(T)之間具有顯著差異豐度的細菌分類群的LDA評分。

 

 

肝癌的FISH分析  HCC組織的微生物的DNA富集于肝細胞和紅細胞的細胞質中

A.將福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)肝癌切片脫石蠟，再水合。B.這兩種探針最近都被用于分析人類癌癥組織的腫瘤內微生物群。C.細胞核用二脒基苯基吲哚(DAPI)復染。單模染色圖像。D.染色陰性。E.不同染色的合并圖像。黃色箭頭表示擁擠區(qū)域的紅細胞聚集。箭頭表示擁擠區(qū)域外的紅細胞。F.蘇木精-伊紅連續(xù)組織切片染色。

為評估HCC中微生物DNA的分布和豐度，作者使用16S rRNA探針對癌組織及癌旁組織進行FISH實現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)FISH信號分布于癌組織和癌旁組織，主要存在細胞質中；在癌旁組織中作者發(fā)現(xiàn)在釋放最強信號的幾個擴大的竇狀區(qū)無核紅細胞（RBC）中富集了FISH信號（紅細胞在肝竇內的堆積表明受損肝組織嚴重充血）。

 

 

新鮮組織培養(yǎng)    HCC組織中存在活菌和感染性細菌

   為研究HCC組織是否存在活菌，作者收集術后新鮮HCC組織通過組培法檢測活菌的情況，作者通過設置陽性對照和陰性對照分別在好氧與厭氧環(huán)境中進行實驗，發(fā)現(xiàn)陽性對照中環(huán)境樣本在好氧培養(yǎng)下產(chǎn)生了數(shù)千個菌落，而厭氧培養(yǎng)產(chǎn)生了30+可見菌群，陰性對照沒有產(chǎn)生可見菌，表明組培法的可靠性是比較高的。作者通過對培養(yǎng)出來的菌群進行菌落PCR和16S rDNA測序，共鑒定出13個菌落，其中2個菌落為金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、8個菌落為羅氏菌屬（Rothia）兼性厭氧菌，2個菌落為芽胞桿菌（Bacillaceae）的好氧菌，1個是屬于棒狀桿菌（Corynebacterium sp.）的嗜氧微細菌。以上結果表明HCC組織中含有活的瘤內細菌。

 

qPCR  采用獨立隊列(qPCR_cohort)對12份組織樣本進行定量PCR驗證

為了驗證16SrRNA測序的結果，我們使用來自16S_rRNA隊列和包含12 個樣本的獨立隊列（qPCR_cohort）的樣本對Gammaproteobacteria進行qPCR分析。與16SrRNA基因測序的結果一致，癌組織中的Gammaproteobacteria豐度顯著更高（Student’st檢驗，16S_rRNA隊列中P= 0.033，qPCR_隊列中P= 0.0005）高于正常樣本。

qpcr_隊列包含6例HCC癌和6例癌周標本，分別來自臨床手術中7例男性和3例女性患者。

本文介紹了微生物群與HCC的關系，并探討了與HCC進展相關的腫瘤內微生物群，發(fā)現(xiàn)HCC微生物群多樣性增加。其中，鏈球菌科和乳球菌被認為是HCC肝硬化的標志。

 

5.2  腫瘤胞內菌促進乳腺癌的轉移定植  16s+qPCR+FISH

該研究利用小鼠自發(fā)乳腺癌模型，通過qPCR和16S測序，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織相對于環(huán)境對照和陰性對照有大量的微生物存在，并且腫瘤組織和正常組織的細菌來源類似，但是從“屬”的水平來看，腫瘤組織有特定的微生物分布特征。這項研究揭示了腫瘤微生物群落在乳腺癌轉移中的潛在作用，并為開發(fā)新的癌癥治療策略提供了科學依據(jù)。

5.2.1方案設計流程

 

5.2.2采集類型

新鮮的正常乳腺組織、乳腺腫瘤組織和淋巴轉移組織立即用無菌DMEM培養(yǎng)基轉移到15ml的無菌錐形管中。樣品在干凈無菌的細胞培養(yǎng)罩中用高壓滅菌的解剖工具進行處理。腫瘤組織切成1mm小塊。

5.2.3結果展示

qPCR絕對定量及細菌培養(yǎng)  乳腺癌組織中存在活的胞內菌

組織與自發(fā)乳腺癌（BT）模型小鼠腫瘤組織菌群的qPCR絕對定量及細菌培養(yǎng)分析

本研究在小鼠自發(fā)乳腺癌（BT）模型中構建了嚴格的腫瘤菌群研究體系。實驗設置了4個分組：負對照（NTC）、環(huán)境背景對照（EBC）、小鼠正常乳腺細胞、小鼠乳腺腫瘤細胞。通過經(jīng)過優(yōu)化的Taqman qPCR檢測（16S rDNA V9區(qū)），發(fā)現(xiàn)雖然正常乳腺細胞也含有一些胞內菌，但是乳腺癌組織的胞內菌的豐度有近10倍的顯著增加。隨著腫瘤體積的增大，細菌密度相對保持不變。通過平板培養(yǎng)，進一步確定了證明這些胞內菌是活菌，并且在乳腺癌組織中的細菌載量要顯著多于正常組織。

16S擴增子測序 不同分組中胞內菌的多樣性不同

胞內菌多樣性分析

實驗進一步通過16S擴增子測序來檢測組織胞內菌的組成。由于組織的胞內菌生物量非常低，因此本研究優(yōu)化了16S文庫構建程序，包括對16S rDNA V4區(qū)進行檢測，以及增加生物素富集步驟以減少非特異性基因組序列。最終獲得了比常規(guī)腸道微生物檢測方法靈敏度高得多的10⁴當量細菌/g組織的可靠結果。結果發(fā)現(xiàn)，對照組（NTC和EBC）、正常乳腺組織和BT組織中在門和屬水平具有不同的微生物群落組成。PCA結果也具有顯著差異。陰性對照樣品中的大多數(shù)微生物是變形菌門，而組織樣品中富集了厚壁菌門。排除污染后，研究者發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，BT組織的α多樣性降低，表明某些微生物的選擇和擴增。BT組織顯示出厭氧菌的急劇減少和兼性厭氧菌的顯著增加。以上結果表明，自發(fā)腫瘤組織中確實含有大量的活細菌。

16S熒光原位雜交(FISH)分析  大量腫瘤常駐菌位于胞質中

     利用16S熒光原位雜交(FISH)分析、脂多糖(LPS)染色、脂磷壁酸(LTA)染色技術，以及高分辨率電子顯微鏡，研究者進一步發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織細胞中有大量微生物的存在，而這些結果在通過抗生素處理實驗中進一步得以驗證。

大量常駐菌位于細胞質中

這項研究揭示了腫瘤微生物群落在乳腺癌轉移中的潛在作用，并為開發(fā)新的癌癥治療策略提供了科學依據(jù)。

 

5.3 擴增在晚期非小細胞肺癌患者中:現(xiàn)實世界的比較研究16s+FISH+ddPCR

文章旨在評估血漿ddPCR和組織NGS在檢測局部晚期或轉移性NSCLC患者MET擴增的性能，并與組織樣本的熒光原位雜交（FISH）技術進行了比較。血漿ddPCR與FISH具有較高的一致性（敏感性74.1%、特異性92.5%和準確度87.2%，kappa值為0.68），在MET擴增檢測方面優(yōu)于組織NGS（kappa值為0.64）。血漿ddPCR和組織NGS聯(lián)合檢測與FISH具有較高的一致性（敏感性92.3%、特異性89.2%和準確度90.1%，kappa值為0.77）。對于FISH和血漿ddPCR檢測到MET擴增并接受MET-TKI治療的NSCLC患者，其療效相當。

5.3.1采用的檢測方法：

? FISH：作為檢測MET擴增的金標準，用于評估腫瘤組織樣本中的基因拷貝數(shù)（GCN）和MET與染色體7中心粒（MET/CEP7）的比率。

? ddPCR：一種先進的技術，用于絕對定量核酸分子，無需標準曲線。它通過將反應分成包含單個核酸模板分子的數(shù)千個微滴來檢測基因突變或表達豐度，具有0.1%的靈敏度。

? 組織NGS：評估MET擴增，通過計算與正常MET狀態(tài)樣本池建立的基線相對的GCN比率。

5.3.2 樣本類型

所有患者通過腫瘤組織活檢使用FISH進行MET擴增檢測，并在活檢前后約2周收集成對血漿樣本。如果有腫瘤組織，則進行組織NGS。

ddPCR檢測：組織樣本的gDNA約為12ng，外周血樣本的cfDNA至少為1.2ng

 

5.3.3結果展示

設置 ddPCR 的截止值

為了確定血漿ddPCR 的截止值，我們首先驗證了其在健康個體中的一致性。我們分析了141份接受常規(guī)醫(yī)學檢查的志愿者外周血樣本，發(fā)現(xiàn)ddPCR比值均勻分布在1.0和1.2之間，平均在1左右。然后我們分析38份肺癌組織和49份已確認 FISH 結果的肺癌患者血漿。發(fā)現(xiàn)MET陽性組織血漿和組織ddPCR比值均超過2，而MET陰性組織血漿和組織ddPCR比值低于2。得到的ROC曲線的曲線下面積(AUC)分別為血漿和組織的0.998和1.00，因此我們將ddPCR檢測MET擴增的截止值設為2.0。

 

FISH和ddPCR MET擴增診斷性能一致性分析

（a）MET-FISH陽性組和陰性組ddPCR比率的小提琴曲線圖。（b）MET-FISH陽性組和MET-ddPCR陽性組的維恩圖。

（b）ddPCR陽性和FISH陽性樣本之間的總體相關性。（d）血漿ddPCR的ROC曲線分析。

AUC曲線下面積；ddPCR液滴數(shù)字聚合酶鏈反應；FISH熒光原位雜交；MET間質-上皮轉化；ROC受試者工作特征。

FISH 是檢測MET擴增的標準方法。本研究基于94份配對樣本，評估了血漿 ddPCR與FISH檢測MET擴增的一致性。不同臨床分期和腫瘤負荷的血漿ddPCR MET擴增檢測無顯著差異。我們的分析顯示 FISH 陰性組和陽性組的血漿ddPCR比率存在顯著差異，平均比率分別為1.59和2.82 圖2（a）血漿ddPCR陽性(n=25) 和FISH陽性(n=27)重疊率為62%圖2（b）5份FISH陰性樣本經(jīng)血漿 ddPCR 檢測呈陽性，7份FISH 陽性樣本經(jīng)血漿 ddPCR檢測呈陰性，靈敏度、特異性、準確度和kappa值分別為74.1%、92.5%、87.2% 和0.68圖2（c）此外，ROC曲線顯示血漿ddPCR檢測MET擴增的AUC為0.861 圖2（d）。這些發(fā)現(xiàn)表明血漿ddPCR和FISH在檢測MET擴增方面具有相當?shù)囊恢滦浴?/span>

 

于ddPCR方法的MET FISH 擴增的診斷性能

由于腫瘤組織量不足，3例患者無法進行NGS分析，其中1例為FISH陽性，另2例為FISH陰性。其余91例（96.8%）同時獲得了FISH和NGS結果。與血漿ddPCR結果相似，組織NGS陽性（n=18）和FISH陽性（n=26）也較常見（57%）[補充圖S2(A)]。2例FISH陰性病例為組織NGS陽性，10例FISH陽性病例為組織 NGS 陰性。因此，組織NGS檢測MET擴增的靈敏度、特異性、準確度和κ值分別為61.5%、96.9%、86.8% 和0.64[補充圖 S2(B)]。雖然組織NGS與FISH的MET擴增一致率高于我們中心之前報告的值（62.5%），但血漿ddPCR方法在數(shù)值上表現(xiàn)出了更優(yōu)異的性能。

 

這項研究支持了血漿ddPCR在檢測晚期NSCLC患者MET擴增中的效用和可行性，并指出了進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)的前瞻性臨床試驗的必要性。

 

5.4  人類肝細胞癌和鄰近非腫瘤組織的微生物概況概述： 16S+FISH

腫瘤內微生物群落最近被發(fā)現(xiàn)存在于多種癌癥中，并被發(fā)現(xiàn)復雜地參與腫瘤進展。因此，研究肝細胞癌(HCC)中腫瘤內微生物分布的特征和功能是必要的。

 

 

5.4.1采用的檢測方法：

? 對HCC組織進行了熒光原位雜交(FISH)，從而驗證微生物在HCC中的存在。

? 使用16S rRNA測序技術對99個臨床收集的肝癌和相鄰非癌組織進行MiSeq測序，得到了兩者內部微生物的全面圖譜。發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的微生物群落多樣性（包括α和β多樣性）顯著高于癌旁組織。

5.4.2樣本類型

肝癌及癌旁組織標本。所有腫瘤組織及鄰近組織均行手術切除。

5.4.3結果展示

熒光原位雜交(FISH)證實了肝細胞癌中存在細菌

A.肝細胞癌組織和癌旁組織的H&E染色。  評估HCC和非腫瘤組織的典型特征B.細菌16S rRNA序列的B-FISH分析證實了細菌在HCC中的存在。HCC組織中含有細菌，盡管數(shù)量較少。C.代表性免疫細胞染色。CD68+細胞和CD45+細胞中均有細菌。其中CD68+細胞被認為是巨噬細胞。

16S rRNA測序  肝細胞癌和癌旁組織微生物群組成的差異

A.序列數(shù)據(jù)的稀疏度曲線。在特定的測序深度下，曲線趨于平緩，即數(shù)據(jù)量的增加產(chǎn)生的新otu相對較少，說明我們的測序數(shù)據(jù)深度是合理的。B. HCC和癌旁組織中不同樣品覆蓋率的核心微生物。在不同的樣品覆蓋水平下，從HCC和癌旁組織中獲得的樣品中共享微生物的數(shù)量是一致的。在所有樣品中鑒定出15種核心微生物，并且在HCC和癌旁組織中一致。C.組間OTU數(shù)的集合分布分析。腫瘤組織中有263個獨特的otu，鄰近組織中有超過241個獨特的otu，這表明兩組之間的微生物種類存在顯著差異。

 

肝癌和癌旁組織中微生物的Alpha 和Beta多樣性

A組間Ace指數(shù)的差異。B組間Chao指數(shù)的差異。C組間 Shannon指數(shù)的差異。D組間Simpson指數(shù)的差異。E基于未加權UniFrac距離的細菌Beta多樣性 PCoA。F基于ANOSIM 的微生物群Beta多樣性

以上結果表明HCC和癌旁組織在單個樣本的細菌豐富度和兩組的整體組成上存在顯著差異。

肝癌和癌旁組織微生物組成的差異

A.肝癌和癌旁組織在門水平上的微生物組成。B屬水平上肝癌和癌旁組織的微生物組成。C基于Mann-Whitney U檢驗的研究組在門水平上的微生物差異。D .基于Mann-Whitney U檢驗的研究群體在屬水平上的微生物差異

基于LEfSe和隨機森林識別肝細胞癌與癌旁組織之間的微生物組及其功能的差異

A.基于LEfSe和隨機森林的HCC和癌旁組織間微生物組及其功能的差異包含從門到屬水平的不同細菌分類群的進化圖譜。B.屬水平微生物群差異LDA直方圖。C.根據(jù)隨機森林算法確定的對群體差異貢獻最大的微生物。D .基于KEGG數(shù)據(jù)庫的組間代謝途徑差異。E .基于MetaCyc數(shù)據(jù)庫的組間代謝途徑差異。

文章綜合評價了HCC組織的瘤內微生物圖譜，初步探討了微生物群落參與脂質代謝變化及影響HCC進展的作用機制，為該領域的進一步研究奠定了基礎。

 

5.5 利用培養(yǎng)組學技術分離培養(yǎng)肺部微生物群研究 16S+培養(yǎng)組學

使用培養(yǎng)組學技術分離培養(yǎng)肺部微生物群，初步了解人體肺部可培養(yǎng)細菌的組成特點，建立呼吸道微生物菌庫，為以后進行重點菌株的功能研究提供菌株條件。

培養(yǎng)組學工作流程示意圖

針對6個臨床肺泡灌洗液樣本，使用補充不同添加劑的血培養(yǎng)瓶對樣本進行預增菌，在預增菌不同的時間點對血培養(yǎng)瓶內細菌進行分離培養(yǎng)和保藏，使用MALDI-TOF質譜和16S rRNA基因測序鑒定分離菌株。

共獲得101種已鑒定細菌，6株潛在新菌，2株真菌。其中細菌包括5個門、14個綱、24個目、35個科和45個屬。預增菌前期的時間點分離菌種數(shù)較多，厭氧環(huán)境分離菌種多于需氧條件，在預增菌時添加羊血和瘤胃液起到良好的分離效果，本實驗分離的肺部微生物群與人體其他部位(尤其是腸道)有很大的交叉。

肺部微生物群分離培養(yǎng)情況

6個樣本中分離細菌總體情況  A: 6個樣品中分離細菌的數(shù)量;B:不同肺泡灌洗液樣本間分離細菌的維恩;C:從6個樣品中分離出的細菌及其在每個樣品中的分布。

利用培養(yǎng)組學技術可以實現(xiàn)對肺部微生物群的分離培養(yǎng)，繼續(xù)探索對肺部微生物群培養(yǎng)的優(yōu)化方法具有現(xiàn)實意義。

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參考文獻：

1. Bacteria and tumor: Understanding the roles of bacteria in tumor genesis and immunology

2. Intratumor microbiome in cancer progression: current developments, challenges and future trends.

3. The Intratumoral Bacterial Metataxonomic Signature of Hepatocellular Carcinoma.

4. Tumor-resident intracellular microbiota promotes metastatic colonization in breast cancer .

5. Plasma ddPCR for the detection of MET amplification in advanced NSCLC patientsa comparative real-world study.

6. Overview of microbial profles in human hepatocellular carcinoma and adjacent nontumor tissues.

7. 利用培養(yǎng)組學技術分離培養(yǎng)肺部微生物群研究。