根系內(nèi)生菌樣本的采集保存方法

 1 樣本的采集

通常采用5點采樣法進行取樣，采集包含植物根系的整塊土壤樣本。采用抖土法抖掉與根系松散結(jié)合的土壤，然后將于根系緊密結(jié)合的土壤刷下來。為了防止微生物死亡或者 DNA 降解，建議采樣后將植物根系進行冰凍保存。將根系和根際土放入冰盒（干冰+泡沫盒）中進行低溫運輸，帶回實驗室進行處理（為了保證樣本在統(tǒng)計學(xué)上有意義，每種類型樣本至少采集 3 個）。每個根系樣本請?zhí)峁?5~10g。

 2 樣本的處理

2.1 超聲波清洗法

將根系樣本從冰盒取出后，立刻用無菌 PBS 進行第一次沖洗，沖洗后的液體可作為根際微生物樣本。之后將根系放入盛有無菌 PBS 的無菌的管子中，用超聲波對其進行第二次沖洗，此次沖洗后的液體作為根表微生物樣本。之后再把根系放入盛有無菌 PBS 的無菌的新管子中，運用超聲波對其進行 2 次沖洗，此次沖洗后的根系為研究根系內(nèi)生菌的樣本。每次超聲波使用的頻率為 42kHz，30s [1]。

2.2 震蕩清洗法

將根系樣品放入無菌三角瓶中，加入無菌的 TE 緩沖液，通過搖床震蕩將微生物細胞從根系表面釋放出來，用玻璃棉對植物懸液進行過濾，收集過濾液。將過濾后的根系放入新的無菌三角瓶中、浸泡在新的無菌 TE 緩沖液中，繼續(xù)搖床震蕩，過濾。反復(fù)震蕩過 4 次。用第4次洗脫后的根系樣品，提取內(nèi)生菌的DNA。搖床的設(shè)定為 350rpm，5min [2,3]。

2.3 表面消毒法

將采集的新鮮植物根系上的雜物用自來水清洗干凈，切成小段，吸干水分；稱?。眊水稻根部組織，用5%次氯酸鈉浸泡消毒1min，75%酒精浸泡消毒１min， 再用無菌水清洗 2~3 次至消毒液徹底洗掉，用滅菌濾紙將水分吸干；取最后一次漂洗液涂布于平板以檢測表明消毒是否徹底[4]。

 3 樣本保存和寄送

將處理好的根系放入滅菌的管子或滅菌的袋子中，放入-80℃冰箱進行低溫保存，若條件不允許，可短期（1 個月內(nèi)）在-20℃冰箱中冷凍保存。注意在樣本凍存期間，請勿反復(fù)凍融。

送樣時請盡量使用冰盒（泡沫盒+干冰+冰袋），以保證運輸過程中的低溫條件（干冰的揮發(fā)消耗量約為 3 公斤/天）。在打包時先放入足量的干冰，之后用冰袋填充泡沫盒中間的空隙，為了保持冰盒中的低溫環(huán)境，建議采用厚一點的泡沫盒。

 4 參考文獻

[1] Joseph Edwards, Cameron Johnson, Christian Santos-Medellin, et al. 2014.
Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. PNAS.

[2] 任改弟. 2013. 水稻葉圈和根圈微生物對大氣 CO2 濃度和土壤溫度升高的響應(yīng).中科院南京土壤所博士論文.

[3] Amanda J. Redford, Noah Fierer. 2009. Bacterial Succession on the Leaf Surface: A Novel System for Studying Successional Dynamics. Plant Microbe interactions.

[4] Barzanti R, Ozino F, Bazzicalupo M, et al. 2007. Isolation and characterization of endophytic bacteria from the nickel hyperaccumulator plant Alyssum bertolonii. Microbial Ecology.