特定微生物菌群（比如特定Species, Genus或幾十株特定微生物菌株）特異性引物、探針設(shè)計(jì)

微生物研究工作中，我們常常需要檢測(cè)某些特定微生物的數(shù)量，比如特定種(Species)或特定屬(Genus),甚至特定科（Family）微生物的存在和數(shù)量。

采用qPCR及ddPCR技術(shù)，理論上，可以進(jìn)行特定微生物菌群的定量檢測(cè)，但要求其對(duì)應(yīng)的qPCR及ddPCR引物、探針，可以特異性檢測(cè)到該類微生物菌群，而與非該類的微生物不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。

眾所周知，微生物具有較高的變異率，因此哪怕是同一個(gè)種(Species)水平內(nèi)的微生物菌株，菌株間基因組的整體差異度有可能會(huì)高達(dá)30%以上。能選做特定菌群檢測(cè)靶點(diǎn)的基因，需要在所有待檢測(cè)的微生物菌群中具有相當(dāng)高的同源性，而在其他所有的微生物菌群中，其序列相似性應(yīng)盡量低一些。

基于上述原因，能很好設(shè)計(jì)出滿足上述要求的引物、探針的難度較高。微基生物推薦采用的特定微生物菌群特異性引物、探針設(shè)計(jì)策略，是基于目標(biāo)微生物全基因組序列來進(jìn)行排查設(shè)計(jì)的，不推薦只利用16S，ITS 等一段特定基因序列。基于全基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，可供篩選的基因靶點(diǎn)大大豐富，更有利于篩選出優(yōu)秀的特異性引物、探針。但這樣一來，大幅增加了工作難度和工作量，微基生物經(jīng)過潛心研發(fā)、實(shí)踐，在過去5年中，我們已經(jīng)成功為眾多客戶設(shè)計(jì)、驗(yàn)證出上190余種特定微生物菌群的特異性引物、探針，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，如您有特定微生物菌群特異性引物、探針的設(shè)計(jì)需求，歡迎聯(lián)系我們: 400-660-9270，我們將竭誠幫助您達(dá)成實(shí)驗(yàn)目標(biāo)。

下面我們將以產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca 的特異性引物、探針設(shè)計(jì)，來說明此類引物、探針的設(shè)計(jì)原理及流程。

 

示例：

產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca特異性引物探針設(shè)計(jì)

產(chǎn)酸克雷伯菌鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=571

1.在NCBI的基因組Genbank、Refseq數(shù)據(jù)庫中，檢索下載產(chǎn)酸克雷伯菌全部已知菌株的基因組序列。

下載了Genbank數(shù)據(jù)庫347個(gè)基因組，Refseq數(shù)據(jù)庫275個(gè)基因組，共計(jì)622個(gè)基因組序列。

 

2.對(duì)上述622個(gè)已知菌株基因組，提取其CDS序列，沒有CDS序列的基因組使用軟件prodigal預(yù)測(cè)CDS；

 

3.使用軟件cdhit對(duì)上述所有CDS聚類，并得出每條CDS在各自基因組中的拷貝數(shù)信息；

 

4.篩選在上述622條基因組中都存在，且單拷貝的共有核心基因序列；

 

5.將上述共有核心基因序列，分別與NCBI的NT庫、Refseq 數(shù)據(jù)庫、檢測(cè)宿主基因組數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)。

篩選出在NT庫和Refseq庫中擊中不了其他物種，也擊中不了宿主基因組的基因序列（下稱候選靶標(biāo)基因序列）；用于后繼引物、探針的設(shè)計(jì)。

 

6. 針對(duì)每個(gè)候選靶標(biāo)基因序列，調(diào)取622個(gè)已知菌株基因組中對(duì)應(yīng)的基因序列，利用生信軟件統(tǒng)計(jì)其每個(gè)位置上的序列多樣性，選擇高保守的序列進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)；

7.采用oligo軟件驗(yàn)證引物和探針，查看引物探針的退火溫度等信息；

 

 

8.將引物、探針與NCBI進(jìn)行blast比對(duì)，查看引物探針的特異性；

上游引物

下游引物

探針序列

9. 合成引物、探針，采用PCR、qPCR、ddPCR驗(yàn)證其擴(kuò)增特異性、靈敏度、抗宿主基因組干擾性，正式開展特定菌群的絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)。

 

9.1引物特異性試驗(yàn)

 瓊脂糖凝膠電泳：引物對(duì)2株陽性檢測(cè)菌株及20株陰性檢測(cè)菌株擴(kuò)增結(jié)果。

9.2 qPCR擴(kuò)增靈敏度測(cè)試，qPCR擴(kuò)增特異性測(cè)試（溶解曲線）

9.3 ddPCR定量驗(yàn)證

引物特異性是決定定量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一。引物設(shè)計(jì)理論結(jié)合特異性試驗(yàn)這種方法可以快速有效地篩選出特異性較好的引物。

補(bǔ)充拓展：

1.ChatGTP來答疑：特定微生物qPCR探針引物設(shè)計(jì)，大致策略？

引物和探針是影響熒光定量PCR成功與否以及其結(jié)果是否可靠的關(guān)鍵因素之一。

 

2.特異性引物與通用引物不同：

以細(xì)菌為例，通用引物就是對(duì)所有種類的細(xì)菌都通用，即用通用引物可以PCR擴(kuò)增所有細(xì)菌的某段DNA。

特異性引物只能用于某種或某類細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增。

 

3.引物質(zhì)量判斷

擴(kuò)增效率熔解曲線引物的擴(kuò)增效率達(dá)到90%-110%，線性相關(guān)性R2>0.98即認(rèn)為擴(kuò)增效率較好。熔解曲線單峰且通常Tm>80℃即認(rèn)為擴(kuò)增特異性較好。 

 

 微基生物推出屬特異性引物設(shè)計(jì)服務(wù)，能更有效的：

a.鑒定特定物種，以及檢測(cè)某一微生物群落中是否包含該物種。

b.確定特定物種在整個(gè)微生物群落中的豐度。