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高通量測(cè)序平臺(tái)相關(guān)問(wèn)題

PCR-DGGE相關(guān)問(wèn)題

常規(guī)樣本寄送及保存

高通量測(cè)序平臺(tái)相關(guān)問(wèn)題

1、什么是OTU 、PCA、RDA？
　　答：OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。
　　PCA即主成分分析。將多個(gè)變量通過(guò)線(xiàn)性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。
　　 RDA即冗余分析，對(duì)比主成分分析可以發(fā)現(xiàn)，其實(shí)冗余分析就是約束化的主成分分析。

2、什么是Reads、Run、Barcode？
　　答：Reads: 高通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的序列標(biāo)簽就稱(chēng)為reads。
　　Run：指高通量測(cè)序平臺(tái)單次上機(jī)測(cè)序反應(yīng)。
　　Barcode：與Index同義，多指在Roche GS FLX 454測(cè)序平臺(tái)的16S PCR產(chǎn)物的測(cè)序過(guò)程中接頭序列所包含的的用來(lái)區(qū)分不同樣本的序列。

3、什么是高通量測(cè)序（NGS）？
　　答：高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序革命性的改變, 一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定, 因此在有些文獻(xiàn)中稱(chēng)其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變, 同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(Deep sequencing)。

4、高通量測(cè)序平臺(tái)和DGGE分析環(huán)境微生物多樣性，它們之間的區(qū)別？
　　答：一般認(rèn)為土壤、海洋、腸道等生態(tài)系統(tǒng)中的微生物數(shù)量繁多、種類(lèi)多樣。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只限于對(duì)環(huán)境樣品中極少部分（0.1%-1%）可培養(yǎng)的微生物類(lèi)群的研究。 DGGE技術(shù)操作復(fù)雜、成本高、痕量菌發(fā)現(xiàn)困難，在其實(shí)驗(yàn)結(jié)果中往往只含有數(shù)十條條帶，只能反映出樣品中的優(yōu)勢(shì)種群，也無(wú)法得到細(xì)菌種類(lèi)的絕對(duì)數(shù)量。而高通量測(cè)序技術(shù)能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)種群及微量的劣勢(shì)種群進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進(jìn)行數(shù)字化，而且每個(gè)樣品的測(cè)序量達(dá)到普通測(cè)序的幾百倍，而單條序列的測(cè)序費(fèi)用遠(yuǎn)低于普通測(cè)序。

5、Misq平臺(tái)和羅氏454平臺(tái)之間的區(qū)別在于？
　　答：羅氏454高通量測(cè)序技術(shù)能同時(shí)對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種、稀有物種及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進(jìn)行數(shù)字化。測(cè)序費(fèi)用比較高，后期數(shù)據(jù)分析比較麻煩。MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)集中了Roche 454和Illumina HiSeq 2500的優(yōu)點(diǎn)，不僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測(cè)序，而且在測(cè)序速度和測(cè)序通量上都有進(jìn)一步提升，而且測(cè)序費(fèi)用相對(duì)于羅氏454便宜很多，后繼分析沒(méi)有那么麻煩。

6、做高通量平臺(tái)分析整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是多少天？
　　答：根據(jù)不同客戶(hù)的要求，實(shí)驗(yàn)周期也不盡相同。我們?cè)诮拥娇蛻?hù)提供的樣品后，即刻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，至全部實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析結(jié)束，一般控制在40個(gè)工作日內(nèi)完成。

7、需要多少測(cè)序量？
　　答：由于不同環(huán)境樣品的物種成分、豐度都各不相同，所需的測(cè)序量也不一樣。我們會(huì)根據(jù)合作伙伴樣品的具體情況及研究目的，進(jìn)行測(cè)序深度數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，給合作伙伴提供合理建議。

8、測(cè)序條數(shù)？
　　答：我們保證單個(gè)樣本測(cè)序條數(shù)高于1.8萬(wàn)條/樣本，樣本平均測(cè)序條數(shù)高于3萬(wàn)條/樣本。同時(shí)可以按照客戶(hù)需求增加測(cè)序條數(shù)。

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果含那些數(shù)據(jù)？
　　a. 匯總統(tǒng)計(jì)全部的測(cè)序結(jié)果。
　　b. 將全部序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行聚類(lèi)/OTU劃分， 列出每個(gè)OTU的代表序列。
　　c. 種屬鑒定，與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，判斷每類(lèi)OTU詳細(xì)的分類(lèi)信息。
　　d. 熱圖分析
　　e. PCA分析
　　f. 根據(jù)測(cè)序序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。
　　h. VENN 圖
　　i. RDA 分析?

PCR-DGGE相關(guān)問(wèn)題

1、什么是DGGE？
　　答：DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即變性梯度凝膠，是利用DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開(kāi)。

2.DGGE應(yīng)用領(lǐng)域
　　答：DGGE作為一種成熟的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

3、是否可以參與實(shí)驗(yàn)？
　　答：公司原則上不允許參與實(shí)驗(yàn)的，可以參觀實(shí)驗(yàn)室。

4、一板DGGE膠的樣品量？
　　答：DGGE膠板一般是16個(gè)孔，但是由于電泳過(guò)程中，膠兩側(cè)的電流會(huì)影響兩邊的電泳效果，導(dǎo)致條帶扭曲。為了保證后記實(shí)驗(yàn)分析的準(zhǔn)確性，建議在12個(gè)樣品以?xún)?nèi)。

5、樣品能否返還？
　　答：根據(jù)客戶(hù)的需求，如果需要返還，由公司工作人員聯(lián)系客戶(hù)后寄送。如果不需要返還，我們會(huì)在實(shí)驗(yàn)完成后60天后將樣品進(jìn)行銷(xiāo)毀處理。

6、實(shí)驗(yàn)周期？
　　答：根據(jù)不同客戶(hù)的要求，實(shí)驗(yàn)周期也不盡相同。我們?cè)诮拥娇蛻?hù)提供的樣品后，即刻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，至全部實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析結(jié)束，一般控制在40個(gè)工作日內(nèi)完成。

7、DGGE分析原核微生物多樣性，主要分析哪些區(qū)域？選擇區(qū)域的依據(jù)是什么?
　　答：公司針對(duì)原核微生物的9個(gè)高變區(qū)域都進(jìn)行過(guò)多樣性分析，目前客戶(hù)做的最多的還是V1-V3區(qū)域。我們可以根據(jù)客戶(hù)的要求，選擇相應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)域。

8、真核微生物多樣性分析，主要做哪些區(qū)域？
　　答：真核生物主要是做V1-V3區(qū)域。真菌可以針對(duì)ITS1、ITS2進(jìn)行分析。

9、克隆轉(zhuǎn)化能保證多少個(gè)有效的測(cè)序結(jié)果？
　　答：根據(jù)客戶(hù)的要求，每個(gè)條帶可以提供3個(gè)有效序列。

10、DGGE分析微生物群落要做平行樣嗎?
　　答：DGGE分析環(huán)境微生物多樣性，一般不需要做平行樣。

11、如何保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性？
　　答：我們?cè)诿恳徊綄?shí)驗(yàn)操作過(guò)程中都會(huì)防止各個(gè)樣品之間出現(xiàn)交叉污染的情況，從基因組DNA提取到最后的克隆轉(zhuǎn)化，我們都嚴(yán)格把關(guān)，確保每個(gè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。

12、如果實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)期不符，如何解決？
　　答：如果出現(xiàn)該種情況，我們會(huì)綜合考慮多種因素，具體解決方案由雙方協(xié)商解決。

常規(guī)樣本寄送及保存

　　1、基因組DNA：樣品濃度不低于50 ng/ul，總體積不少于20 ul。對(duì)于未抽提的基因組DNA，樣本量不低于2g.(如土壤、糞便、動(dòng)物組織、腸道內(nèi)容物等)
　　2、水樣：2L以上水過(guò)濾后的濾膜，若環(huán)境中微生物豐富，可適當(dāng)減少水的體積。
　　3、分泌物：2-3 mL（唾液、鼻涕、汗液、淚水等）
　　4、非致病性：如果您的菌體帶有致病性，請(qǐng)您提供加熱處理后的基因組DNA。我們不接受有致病性的樣品。
　　5、寄送溫度：推薦干冰低溫運(yùn)輸。
　　6、請(qǐng)盡量避免樣本送達(dá)時(shí)間在節(jié)假日，以確保您的樣本能及時(shí)送達(dá)。
　　7、特殊樣本或珍貴樣本請(qǐng)?zhí)崆奥?lián)系我公司，經(jīng)我公司允許后寄送。